iCycler iQ装机的几点注意事项.doc

iCycler iQ装机和升级的几点注意事项一、 配套电脑的并口输出模式：iCycler iQ的optical module与配套电脑连接通过并口。要求在电脑启动后进入Bios设置，在并口输出模式（parallel port mode）一栏中选择EPP。二、 Purdy与Mask：将iCycler安装完以后，必须进行Mask（对光路）和Purdy（纯染料校正）调节后才能进入使用状态。1、 MaskMask的目的是将96个检测点的位置与96个反应孔的位置一一对应，保证荧光收集的准确性。步骤如下：1) 取iCycler iQ Solution Kit(170-8792)中的External Well Factor Solution（10）一支（棕色管盖），吸取液体0.5ml，放如一个至少5ml容量的干净的容器中，加入4.5ml蒸馏水稀释至5ml（10倍稀释），混匀。2) 取iCycler iQ PCR Plates（223-9441）一块，在其96个孔中各加入稀释好的External Well Factor Solution（1）50l。3) 加好样后，在板上盖一块干净的光学级封带（Optical-quality sealing tape，223-9444），用刮板刮几下，使封胶与板粘紧。这块准备完的板就叫做External Well Factor Plate 。4) 将External Well Factor Plate 放入机器，盖好盖。打开系统软件，进入Imaging Services窗口；5) 点击“AutoBias”使荧光信号探测器进入最佳工作位置。完成后“Bias”文件框会显示其调整值，再点击该文件框下方的“Save”键保存其设置；6) 点击窗口右下方的“Home”键使滤光镜组归回原位；7) 在“Both Filters”文件框中选择要使用的滤光镜组在选择转轮上的位置选项（一般选择2，既FAM滤光片），在“Exposure”文件框中选择曝光长度；8) 点击“Expose”键。窗口左上方会显示出一幅反应板图象。在该图象上检查有没有孔像素饱和（如果有孔已经饱和，该孔会显示红紫色）。如果发现有孔像素饱和，在“Exposure”文件框中减少其曝光长度直到全部96孔全都没有饱和为止。如果没有发现像素饱和，逐渐增加曝光长度直到有孔出现饱和，然后再减少到其没有像素饱和出现的最大曝光长度；9) 按住键盘上的“Shift”键，点击反应板图象上的A1孔（最左上的那个孔），打开mask文件。您也可以在上方文件框中选择“Show Mask”，然后通过点击窗口上方的方向键选中A1；10) 点击“Auto Init”键，系统会自动调整遮光框到最佳工作位置。无论调整完成或调整失败，系统都会显示相应信息。如果调整失败，重复该步骤一次，如果再次失败，只能使用手动调节（见下文）；11) 遮光框调整完成后，点击“Save Masks”键。本次调整结果将被保存在mask96.ini 文件中（c:Program fileBio-RadiCyclerini）。注意：如果想调整某个孔的遮光框位置，点击反应板图象上的相应孔，其显示色会由绿变蓝，此时点击图象上方的各方向箭头键即可调整其遮光框位置。图象上方的“Inner”显示该孔的内方格读数，“Outer”显示该孔外方格读数，“Saturated”显示该孔的像素饱和度。点击图象内该孔外的任何位置，系统会保存对其的调整，同时该孔显示色由蓝变绿，相应读数和功能键恢复到针对整个反应板的状态。Mask窗口简介窗口顶部的箭头键用来手调遮光框的位置；窗口顶部的的数据分别代表反应板全部96孔平均遮光框内矩阵（Inner）、外矩阵（Outer）读数和已经像素饱和的孔数（Satutated）。用户如果点击96孔模拟布局图上的某孔后，该孔在布局图上会变蓝，而上述三个数据也就分别显示该孔的遮光框内方格、外方格的读数和像素饱和度。窗口右侧可以选择滤光镜选择转轮上的位置（Both Filters）和曝光长度；窗口右下的三个文件框从左到右分别代表：iCycler的光学模块是否接好（Camera ONLINE/OFFLINE）、增强器是否打开（Intensifier ON/OFF）和热盖的情况（Lid）；点击“AutoBias”键后系统会自动调整摄象系统的偏差，使荧光信号探测器进入最佳工作位置；点击“Expose”键后开始曝光，而“Exposure Count”文件框来监控曝光的过程；点击“AutoIni”键后系统开始自动选择最佳遮光框位置并对其进行校正；96孔模拟布局图下面的一系列功能键在手动调节中起辅助作用；可以通过窗口左下侧的“Load”、“Save”键来读取或保存Image文件。2、 PurdyPurdy的目的是消除仪器中所安装的各个滤光片所检测的波长之间的干扰，保证荧光信号处理的准确性。由于每个用户购买仪器时所选择的滤光片各不相同，所以在装机后必须根据其滤光片的安装情况做相应的Purdy。步骤如下：1) 根据所安装的滤光片的不同在iCycler iQ Solution Kit(170-8792)中的取出相应的荧光染料校准溶液。每种荧光染料都有其对应的。该溶液中含有相应荧光标记的寡核苷酸，其浓度都已经调配到最佳工作状态，所以注意，千万不要对其稀释。若一次对多种荧光染料（最多4种）进行校准，那么在纯染料校准反应板上加样的时候，必须将其对应的校准溶液分开加到不同反应管中。例如：用户安装了4套滤光片，分别是180-8777，170-8778，170-8781，170-8782。则分别取FAM，HEX，Texas Red和Cy5各一支。2) 将每种荧光染料校准溶液在反应板上加10个反应管，每孔50l。（注意，千万不要对其稀释）例如：B2-B11反应管中加了FAM校准溶液；D2-D11反应管中加了HEX校准溶液；F2-F11反应管中加了Texas Red校准溶液；H2-H11中加了Cy5校准溶液。3) 加好样后，在板上盖一块干净的光学级封带（Optical-quality sealing tape，223-9444），用刮板刮几下，使封胶与板粘紧。这块准备完的板就叫做Purdy Plate。4) Pudry上机操作设置一个PCR热循环文件，内容为：55oC 1分钟55oC 1分钟 10在软件界面上选择在循环的第二步（55oC ，1分钟，10个循环）进行实时检测（显示黄色照相机状图标）（见图2.7）。设置反应板设置文件。在模拟96孔模拟图上选择各反应管中所含的荧光染料的种类。如图2.8，B2-B11反应管中加了FAM校准溶液；D2-D11反应管中加了HEX校准溶液；F2-F11反应管中加了Texas Red校准溶液；H2-H11中加了Cy5校准溶液。先把前面准备好的做完Mask的External Well Factor Plate放入iCycler，在Protoco Library 模块中选择刚才设置的PCR热循环文件和反应板设置文件，点击“Run”。在“Run Prep”的界面中，输入反应体系的体积，在“Identify Protocol Analysis”选项框中选择“Pure Dye Calibration”。注意，一旦选择该选项，则在“Well Factor Sourse”选项框中“Experimental Plate”选项就会变灰而成为不可选选项（见图2.9）。点击“Begin Run”。给本次数据记录文件起名。此时系统开始收集孔间差异因子数据，详见2.3。其数据收集完毕后，系统自动进入暂停模式（此时显示60无限）。打开盖子，取出External Well Factor Plate，放入Purdy Plate，盖上盖，点击“Continue Running Protocol”。此时系统开始正式进行纯染料校准数据收集，完成后，系统界面会有提示信息跳出（见图2.10）。5) 经过以上步骤后，会在c:Program FileBio-RadiCyclerini文件夹中生成一个RME文件。最好将c:Program FileBio-RadiCycler目录下的整个ini文件夹用一张软盘备份，在用户和你的电脑中保存。这样，一旦该用户的电脑系统发生故障，原文件丢失，可将此文件夹拷贝至这个目录下，而不必再从头做一次了。三、 仪器的升级：iCycler自问世以来，随着仪器功能的增加，已经经历了多次的升级。从最早的软件版本1.0只能做单色荧光，软件版本2.1可以做多色荧光，软件版本2.3可以做熔点曲线分析，到马上出来的软件版本3.0可以做等位基因分析，Real-Time下做梯度等功能，每一次升级都伴随着仪器功能水平的飞跃。在软件升级的同时，也涉及到了firmware的升级。不同的software需要不同的firmware配套，当然firmware的版本是向下兼容的。例如，V2.3的software需要2.033以上的firmware版本配合。Firmware的升级需要在英文版的windows下进行，所以如果用户的电脑如果不是英文操作系统，那么你就最好准备一台英文操作系统的笔记本备用了。升级过程一般如下：1. firmware升级：1) 关闭iCycler电源2) 连接DB9串口线的male端至iCycler Base后端的9 pin接口上3) 连接DB9串口线的另一端至电脑（英文操作系统）的COM口上4) 打开电脑电源5) 打开iCycler电源，等待其通过自检6) 将iQ软件光盘插入CD ROM，将Base Unit目录下的Firmware Upgrade文件夹copy至c:下。7) 打开c: Firmware Upgrade，双击Upgrade.exe文件，此时会出现以下对话框：Old Version:New Version:Proceed to Download: Y/N?8) 如果新的版本比原来的高，则输入Y ；如果新的版本比原来的低，则输入N；如果新的版本和原来的一样，则直接Enter9) 当下载结束后，iCycler会自动重启，电脑屏幕上显示升级结束。2. software升级：1) 如果是用的笔记本升级的，将串口线连回用户电脑。2) 将用户电脑中原有的c:Program fileBio-RadiCyclerini文件夹在一张软盘中或D盘中备份3) 用“控制面板中”的“添加/删除程序”功能将iCycler程序删除。如果直接将c:Program file下的Bio-Rad子目