转基因生物外源基因表达及其安全性.ppt

生物技术 Biotechnology 食品与营养工程学院李西腾 第八章转基因生物外源基因表达及其安全性 一转基因生物外源基因表达 二转基因生物的安全性及其风险评估 第一节转基因生物外源基因表达 一 外源基因表达系统转基因生物技术或称基因工程的最终目的就是要在一个合适的系统中 使外源基因高效表达 从而生产有重要价值的产品 基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类 一 原核生物的外源基因表达系统 外源基因在原核细胞中的表达就是使克隆的外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速 高效地合成基因产物 一 原核生物的外源基因表达系统 1 原核生物基因表达的特点同所有的生命过程一样 外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程 即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质 一 原核生物的外源基因表达系统 与真核细胞相比 原核生物的基因表达有下列特点 原核生物只有一种RNA聚合酶 真核细胞有3种 识别原核细胞的启动子 催化所有RNA的合成 原核生物的基因表达是以操纵子为单位的 即由数个相关的结构基因及其调控区结合构成1个基因表达的协同单位 一 原核生物的外源基因表达系统 由于原核生物无核膜 转录与翻译是偶联的 二者也是连续进行的 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA 转录成mRNA后可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质 原核基因一般不含内含子 在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统 因此 当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成的mRNA前体后 其中的内含子部分就不能被切除 一 原核生物的外源基因表达系统 原核基因表达的控制主要是在转录水平 这种控制比对基因产物的直接控制要慢 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上有1个转译的起始密码子及同16s核糖体RNA3 末端碱基互补的序列即S D序列是真核基因所没有的 一 原核生物的外源基因表达系统 2 外源基因在原核细胞中表达的基本条件 通过表达载体将外源基因导入宿主菌 必须利用原核细胞的强启动子和S D序列等调控元件 外源基因不能带有间隔序列 内含子 外源基因与载体连接后必须形成正确的开放阅读框架 利用宿主菌的调控系统 一 原核生物的外源基因表达系统 3 原核细胞中基因的重要表达调控元件 1 启动子启动子是DNA链上能与RNA聚合酶结合并能起动mRNA合成的核苷酸序列 它是基因表达不可缺少的重要调控序列 没有启动子 基因就不能转录 2 终止子在1个基因的3 末端或是1个操纵子的3 端还有一特定的核苷酸序列 它有终止转录的功能 这一DNA序列称为终止子 二 真核生物的外源基因表达系统 1 真核生物基因及表达的主要特点与原核生物不同 真核生物基因表达具有程序 时间和空间上不同层次的严格 精密的控制 这是由真核基因的复杂性决定的 真核细胞与原核细胞在基因转录 翻译及DNA的空间结构方面都存在很大的差异 真核生物在基因结构及表达方面有着与原核生物不同的特点 二 真核生物的外源基因表达系统 1 真核生物基因及表达的主要特点 基因组DNA的存在形式使基因转录的启动一般不具备快起始的能力 大多数真核DNA都与蛋白质结合成紧密结构 不像原核DNA是裸露的 真核生物一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链 不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式 真核基因的转录和翻译在细胞的不同部位 转录在细胞核内进行面翻译在细胞质中进行 两者既有间隔又有联系 不像原核基因在同一部位进行转译 二 真核生物的外源基因表达系统 1 真核生物基因及表达的主要特点 原核基因转录的调节区小且位于启动子上游不远处 真核基因的调节区不仅要大得多而且可能远离启动子达数百甚至上干个碱基 真核基因中间含有不被翻译的内含子 大多数真核基因的初级转录本不具有功能 需在细胞的一定部位进行剪接加工形成各种中间产物 因而可以通过是否加工mRNA前体来调控基因的表达 真核基因的表达受到多层次的精密调节 比原核基因复杂得多 也涉及更多的蛋白质因子的参与 二 真核生物的外源基因表达系统 2 真核基因的重要表达调控元件真核基因在其表达的转录 转录后加工 翻译 翻译后蛋白的加工 运输及定位等各个环节都取决于一系列重要调控元件的作用 外源基因的表达正是通过这些调控元件来实现的 1 启动子 2 增强子 3 终止子 4 修饰序列 二 真核生物的外源基因表达系统 3 真核生物外源基因表达系统 1 瞬时表达系统在此系统中外源基因没有稳定的整合到宿主细胞染色体中 而是以染色体外的DNA形式存在 因此外源基因只能得到瞬时表达 2 诱导表达系统诱导型基因表达系统对子认识基因在生长发育 生理活动及其病理过程中的作用都具有重要的意义 二 真核生物的外源基因表达系统 3 真核生物外源基因表达系统 3 组成型特异表达系统 乳腺表达系统 膀胱生物反应器 血液表达系统 二 外源基因对转基因生物遗传的影响 转基因技术使人们能够按照自己的意愿 对生命最基本的遗传物质进行直接操作 把所需要的目的基因导入细胞内 使生物体获得新的性状 外源基因被导入宿主并整合进受体DNA后 一旦遗传表达 将表现出新的遗传性状 由于外源基因进入 与内源基因发生相互作用 可能使转基因生物中的外源基因甚至内源基因的遗传表达受到一定影响 二 外源基因对转基因生物遗传的影响 一 转基因生物中外源基因的丢失在基因工程的研究和应用过程中 发现有时在第一代转基因生物体内可以检测出外源基因的存在 在第二代 第三代也还可以检测出来 但在后面几代中就检测不到了 即发生了外源基因丢失 二 外源基因对转基因生物遗传的影响 二 转基因生物中外源基因的次生效应外源基因的次生效应是指由于外源基因的插入而对宿主体内某些基因的表达所产生的影响 目前的技术不能够准确控制外源基因在宿主染色体上的插入位点 所以外源基因可能插入到宿主基因组中的非编码区 结构基因或调控区 从而产生插入突变 预期的结果也就显现不出来 常见的次生代谢效应有两种情况 一是由于外源基因的插入导致宿主体内某一基因失活 二是由于外源基因的插入将宿主体内某一基因激活 由于目前的科学技术水平还很难准确预测一个外源基因在新的遗传背景下会发生什么样的相互作用 因此对外源基因的次生效应尚无法进行控制和预测 二 外源基因对转基因生物遗传的影响 三 转基因生物中的基因沉默外源基因整合后不仅可能引起宿主体内某些基因的失活 外源基因自身也很容易被受体基因组存在的修饰与限制系统所识别并加以修饰和抑制 造成失活和沉默 形式包括 顺式失活和反式失活两种 二 外源基因对转基因生物遗传的影响 四 转基因生物中外源基因的逃逸转基因生物体内整合的外源基因以某种途径转移到其他生物体内或环境中 这种现象称为外源基因的逃逸 外源基因逃逸的途径 转基因作物花粉的散布 这种途径是转基因植物中外源基因逃逸的主要渠道之一 转基因生物分泌物或残骸在环境中的残留 食物链的传递 二 外源基因对转基因生物遗传的影响 五 外源基因在后代中的遗传多样性外源基因在后代中的遗传多样性因转基因个体杂交或转基因个体自交结合 一般来说 外源基因的传递遵循孟德尔遗传规律 自交后代表现3 1的分阁规律 杂交后代表现1 1的分离规律 但是在某些情况下 作为两个不连锁的显性基因在自交后代中也有表现出15 1的分离现象 另外 有一个特殊现象是自交一代符合3 1分离规律 但自交二代却不符合孟德尔分离规律 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 影响外源基因表达的主要因素1 有效的转录起始这是外源基因能否在宿主细胞中表达及其效率的关键步骤之一 起始的速率是基因表达的主要限速步骤 启动子的强弱及相关的调控序列将影响外源基因的表达与否及其表达效率 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 影响外源基因表达的主要因素2 有效延伸和转录终止外源基因的转录一旦起始 接下来的问题是如何保证mRNA的有效延伸 终止以及稳定的积累 尤其在真核细胞中 然而 在转录物内的衰减和非特异性终止可诱发转录中的mRNA分子提前终止 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 影响外源基因表达的主要因素3 mRNA的稳定性是翻译出蛋白质的模板 mRNA的稳定校直接关系到翻译产物的多少 即表达的效率 4 有效的翻译起始和有效的转录起始一样 有效的翻译起始是外源基因表达的关键 起始密码子 核糖体结合位点及其相关核苷酸序列对翻译起始至关重要 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 影响外源基因表达的主要因素5 遗传密码应用的偏倚性不同基因对遗传密码的应用并不是随机的 高表达的基因经常使用偏倚性密码 即使用其常用密码有更高的表达效率 6 mRNA的二级结构无论是原核基因还是真核基因的表达 翻译的起始经常受到mRNA不适当的二级结构的影响 如5 端非翻译区的茎环二级结构 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 影响外源基因表达的主要因素7 RNA转录后加工绝大多数真核基因含有内含子 需在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA 8 mRNA序列上终止密码的选择所有三个终止密码子在它们的终止效率上是不同的 UAA在高水平表达中终止效率最好 若采用一串联的终止密码效果更好 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 影响外源基因表达的主要因素9 表达载体的拷贝数及稳定性在多数情况下 目标基因的扩增程度与基因表达效率成正比 表达载体的稳定性是维持基因表达的必要前提条件 而表达载体的稳定性不但与自身特性有关 也与受体细胞特性密切相关 10 外源蛋白的稳定性外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白酶水解 这是基因高效表达的一个重要参数 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 二 外源基因表达调控的策略1 提高外源基因在原核细胞表达的策略 1 提高翻译水平 2 减轻细胞的代谢负荷 3 提高表达蛋白的稳定性 防止外源蛋白被降解 三 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 二 外源基因表达调控的策略2 提高外源基因在真核细胞表达的策略 1 转录前 基因水平 调控 2 转录水平调控 3 转录后调控 4 翻译水平调控 四 基因表达调控技术 一 反义RNA1 概念反义RNA antisenseRNA 是指与靶RNA 多为mRNA 具有互补序列的RNA分子 它通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与基因的表达调控 四 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 反义RNA2 反义RNA的调控方式 1 在核酸复制水平上反义RNA可作为DNS复制的抑制因子 它可与引物DNA前体互补结合 抑制DNA的复制 从而控制复制的频率 2 在转录水平上反义RNA与mRNA5 端互补而阻止RNA的转录 3 在翻译水平上反义RNA在翻译水平上的调控主要表现在三个方面 一是与mRNA5 端非翻译区包括S D序列的结合 直接抑制翻译 二是与mRNA5 编码区 主要是起始密码子AUG结合 抑制翻译起始 三是靶mRNA的非编码区互补结合 间接抑制mRNA的翻译 四 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 一 反义RNA3 反义RNA的应用 1 植物学研究中的应用 控制果实成熟 提高植物抗病性 改变花卉的颜色 控制植物淀粉的合成 控制油料植物种子中脂肪酸的合成 控制雄性不育 2 反义RNA在动物及人类疾病治疗上的应用 对疾病基因的具有调控作用 在人类疾病治疗中的应用 四 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 二 基因敲除1 概念基因敲除 geneknockout 是指对一个结构已知但功能未知的基因 从分子水平上设计实验 将该基因去除 或用其他序列相近的基因取代 然后从整体观察实验生物 推测相应基因的功能 基因敲除可中止某一基因的表达外 还包括引入新基因及引入定点突变 既可以是用突变基因或其他基因敲除相应的正常基因 也可以用正常基因敲除相应的突变基因 目前这项技术主要集中在动物研究上 四 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 二 基因敲除2 基因敲除技术的应用 建立人类疾病的转基因动物模型 为医学研究提供材料 基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理 分子基础及诊断治疗的重要实验材料 改造动物 鉴定新基因或其新功能 研究发育生物学 深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现 可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用 为研究基因的功能和生物效应提供模式 四 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 二 基因敲除2 基因敲除技术的应用 去除多余基因或修饰改造原有异常基因 以达到治疗的目的 改造生物 培育新的生物品种 四 影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 三 RNA干涉1 概念RNA干涉 interference 利用双链RNA可以特异性地降解相应序列mRNA 从而特异性阻断相应基因的表达 2 RNA干涉的应用利用RNA干涉可以实现多基因突变 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特征 设计针对这一区段序列的双链RNA分子 注射一种双链RNA既可以产生多个基因同时剔除的表型 RNA干涉可以产生基因降低表达的各种表型 而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段 第二节转基因生物的安全性及其风险评估 一 转基因生物安全性 一 生物安全概念1 广义生物安全广义的生物安全 是指在一个特定的时空范围内 由于自然或人类活动引起的外来物种迁入 并由此对当地其他物种和生态系统造成改变和危害 人为造成环境的剧烈变化而对生物多样性产生影响和威胁 在科学研究 开发 生产和应用中造成对人类健康 生存环境和社会生活有害的影响 一 转基因生物安全性 一 生物安全概念2 狭义生物安全狭义的生物安全主要是指通过基因工程技术产生的遗传工程体及其产品所带来的上述种种有害影响 本节所述的转基因生物的安全性即属这一范畴 一 转基因生物安全性 二 国内外对转基因生物安全性的看法1 转基因生物安全性问题的由来2 国际社会 科学界和各国政府对转基因生物安全性的认识 二 转基因生物安全性评价 一 生物安全性评价的目的 为转基因生物技术的安全管理和科学决策提供科学依据 有针对性地采取与之相适应的监测和控制措施 保障人类健康和环境安全 回答公众疑问 消除公众由于缺乏全面了解面产生的种种误解 形成对转基因生物安全性的正确认识 提高转基因生物产品的国际竞争能力 促进国际贸易 维护国家权益 促进转基因生物技术作为具有巨大应用前景的产业走上健康有序 可持续发展的道路 二 转基因生物安全性评价 二 生物安全性评价原则 标准和程序1 安全性评价的原则对转基因生物安全性评价应遵守科学 客观 公正 个案评审的原则 针对每项基因工程工作的具体情况确定其安全等级 二 转基因生物安全性评价 二 生物安全性评价原则 标准和程序2 安全等级的划分标准 3 安全等级的划分程序 二 转基因生物安全性评价 三 安全性评价的主要内容生物安全性评价的内容包括对人类健康的影响和对生态环境的影响两个方面 而在每一个方面的具体评价内容则取决于对安全性的理解和要求 同时也与当前生物技术研究与应用的发展认识水平是分不开的 不同国家 不同行业的要求各不相同 1 受体生物的安全等级 2 基因操作对受体生物安全性的影响 3 遗传工程体的安全等级 二 转基因生物安全性评价 三 安全性评价的主要内容4 遗传工程产品的安全等级遗传工程产品的安全等级一般是根据其与遗传工程体的特性和安全性进行比较来确定的 其分级标准与受体生物的分级标准相同 主要评价与遗传工程体比较 遗传工程产品的安全性有何改变 5 基因工程