任务五高效液相色谱仪的使用详解.ppt

仪器分析 生物工程系 任务五高效液相色谱仪的使用 了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围了解高效液相色谱仪的构造掌握高效液相色谱法的使用技术和定量方法 学习目标 一 概述 高效液相色谱法 HPLC 以气相色谱为基础 在经典液相色谱 LC 实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 一 HPLC的特点 二 与经典LC相比HPLC的优点 三 HPLC的适用范围 高压 压力可达150 300kg m2 高速 流速为0 1 10 0mL min 高效 柱效高 在一根柱中同时分离成分可达100种 高灵敏度 紫外检测器可达0 01ng 荧光和电化学检测器可达0 1pg 一 HPLC的特点 二 与经典LC相比HPLC的优点 速度快 通常15 30min一个样 某些样品5min可完成 分辨率高 可选择固定相和流动相达到最佳分离效果 灵敏度高 紫外检测器可达0 01ng 荧光和电化学检测器可达0 1pg 柱子可反复使用 用一根色谱柱可分离不同的化合物 样品量少 容易回收 样品经过色谱柱后不被破坏 三 HPLC的适用范围 适合分析高沸点 热不稳定 离子型的样品 应用范围广泛 适用于医药 环保 石化 生命科学 食品工业 农业等多个领域 在已知的化合物中能用液相色谱分析的可占70 80 一 二 结构 一 工作流程 高压输液系统 色谱柱系统 数据记录处理系统 工作站 检测系统 进样系统 动画 二 工作系统 1 高压输液系统主要部件 贮液器 过滤器 高压输液泵 梯度淋洗装置 二 工作系统 2 进样系统流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置 动画 二 工作系统 3 色谱柱系统柱体为直型不锈钢管 内径1 6mm 柱长5 40cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 二 工作系统 4 检测器系统紫外检测器荧光检测器示差折光检测器光电二极管阵列检测器 二 工作系统 5 色谱工作站以VI2010色谱工作站 软件操作示范 为例 此工作站适用范围广 支持多个检测器 可与任何气相色谱仪 液相色谱仪或带电压输出的电子设备连接 可同时采集一到两个独立检测器信号 三 使用技术 准备 清洗 关机 冲洗柱子冲洗管路关主机关电脑关电源 开机 进样 流动相标液样液柱子选择仪器检查 开电脑 主机 工作站参数设置方法建立进样 操作步骤 1 准备所需的流动相 用合适的0 45 m滤膜过滤 超声脱气20min 2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱 3 准备样品和标准溶液 用合适的0 45 m滤膜过滤 4 检查仪器各部件的电源线 数据线 输液管道是否连接正常 准备 接通电源 依次开启不间断电源 真空脱气机 多元泵 检测器 待泵和检测器自检结束后 打开电脑显示器 主机 最后打开色谱工作站 1 参数设定 波长 流速 流动相比例 梯度 2 更换流动相并排气泡 3 平衡系统 流动相冲洗系统 检查管路是否漏液 观察压力值变化 观察基线变化 4 进样 自动进样 手动进样 开机 进样 1 分析结束 数据处理 打印报告 2 关闭柱温箱和检测器 然后再用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗色谱系统 3 冲洗完毕后 逐步降低流速至0 关泵 4 关闭液相装置 作好使用登记 内容包括日期 检品 色谱柱 流动相 柱压 使用小时数 仪器完好状态等 清洗 关机 四 数据分析 一 谱图判断 二 结果分析 一 谱图判断 分离度 一般应 1 5 重复性 两次谱图的峰面积应相差不超过1 理论塔板数 应 规定的理论塔板数目 拖尾因子 0 95 T 1 05 保留时间 对照与样品的主成分保留时间应大致一致 二 结果分析 1 定性方法利用已知标准品定性利用检测器的选择性定性利用紫外检测器全波长扫描功能定性2 定量方法归一化法外标法内标法 课后思考题 1 外标法定量与内标法定量有何差别 2 流动相在使用前为何要经过脱气处理 实训六高效液相色谱仪的使用 一 实训目的二 实训原理三 实训材料四 实训步骤五 结果分析六 注意事项 一 实训目的 1 了解高效液相色谱仪的构造及工作原理 2 掌握高效液相色谱仪的使用方法 3 学会用单点外标法进行数据处理和结果分析 二 实训原理 利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同 当试样随流动相进入色谱柱中后 组分就在两相间进行反复多次分配 由于固定相对各种组分的吸附能力不同 因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同 经过一定的柱长后 便彼此分离 顺序进入色谱柱 产生的离子流信号经放大 在记录器上描绘出各组分的色谱峰 三 实训材料 1 主要仪器设备 Agilent高效液相色谱仪 HypersilODS C18柱 5 m 4 6 100mm MWD检测器 超声波清洗器 膜过滤装置 2 主要试剂 甲醇 色谱纯 0 02mol L乙酸铵溶液 25 g mL苯甲酸标准溶液 3 样品测试溶液 市售碳酸饮料 所用溶液均经过0 45 m膜过滤 四 实训步骤 1 取市售碳酸饮料约10mL于50mL烧杯中 超声脱气30min后 准确吸取1mL 经滤膜过滤至10mL比色管 以经滤膜过滤的高纯水定容至5mL 2 色谱条件 柱温25 检测波长230nm 进样量20 L 流速1 0mL min 流动相甲醇 乙酸铵溶液 5 95 四 实训步骤 3 开机 打开色谱工作站 4 打开脱气阀 以5mL min流速对流动相进行脱气 5 脱气完毕后 调节流动相流量为1 0mL min 切换脱气阀 打开柱温控制开关 打开UV检测器开关 按色谱条件设置相应参数 6 建立方法和进样序列 四 实训步骤 7 待基线平稳后 调用方法和序列 开始测样 8 测样结束 打印图谱报告 9 关闭检测器和柱温箱 清洗色谱柱及管路 以1 0mL min的流速 先以水清洗色谱柱20min 再以甲醇清洗色谱柱30min 10 关闭色谱工作站 关机 作好使用记录 五 结果分析 1 定性分析以保留时间定性 填写下列表格 五 结果分析 2 定量分析以峰面积定量 根据公式计算样品中苯甲酸的含量 W 样品中苯甲酸的含量 g mL A 样品中被测物质的峰面积 As 标准样品中被测物质的峰面积 C 标准样品的浓度 g mL V2 样液定容体积 mL V1 所取样液体积 六 注意事项 1 流动相必须使用色谱纯试剂 使用前用0 45 m膜或更细的膜过滤 并超声脱气 恢复到室温后使用 2 不能用纯乙腈作流动相 防止单向阀粘住导致泵不进液 3 长时间不用仪器 应将柱子取下用堵头封好保存 注意不能用纯水保存 应该用有机相 如甲醇等 保存 4 C18柱绝对不能进蛋白样品 血样 生物样品