中药药理实验方法学.ppt

第三节中药药理实验设计的基本原则 1 对照 1 正常对照组 空白对照 阴性对照 2 模型对照组 3 阳性对照组意义 检验实验体系是否可靠 粗略估计受试药与对照药相比 作用强度与特点上有哪些差异 4 假手术对照组有时可以替代正常对照 5 自身对照观察同一个体给药前 后的区别 2 随机 目的 1 避免非研究因素影响 2 除研究因素外 提高各比较组的其他因素的均衡性 可比性 3 满足统计学假设检验的要求 抽签随机法 例 30只小鼠 要求随机分为3组 可先将30只小鼠按1至30编号 做1 30号签 充分混合号签后 随机各取10枚为一组 随机数字表法 取P 187 表22 1 第16行 顺序号 A组 1 9 12 13 15B组 2 3 5 7 10 11C组 4 6 8 14按原随机数字顺序继续抄一随机号 08除以6余数 2 将8组第二只 即3号小鼠编入C组 调整后各组的编号 A组 1 9 12 13 15B组 2 5 7 10 11C组 3 4 6 8 14 练习 20个小鼠 根据下例随机数顺序 将其随机分成4组 取P 187 表22 1 第1行随机号 22176865846895239235870222575161094395065824820347 鼠号 12345678910随机号 22176865846895239235除以4余数 2101003303鼠号 11121314151617181920随机号 87022257516109439506除以4余数 3221311332随机号 5824820347 根据余数分组鼠号 A组 24141617B组 1121320C组 781011151819D组 3569继续按顺序抄2个随机号 582458 7余数为2 即C组第2个动物 8号 编入B组 24 6余数为0 即C组余下的6个动物中的第6个 19号 编入D组 调整后随机分组的结果为 按动物号 A组 24141617B组 18121320C组 710111518D组 356919 按随几号大小顺序分组法将20只小鼠随机分成4组 取P 187 表22 1 第1行 鼠号 12345678910随机号 22176865846895239235鼠号 11121314151617181920随机号 87022257516109439506鼠号 12201721138101815随机号 02060917222223354351鼠号 14164365119719随机号 57616568688487929595 分层随机 先将需严格控制的主要因素 如性别 体重等分为不同类别 或层次 在每一类别或层次中分别随机分成一定组 将每一类别或层次随机分成的组 组次相同的分别合并 3 重复 目的 验证在类似的条件是否可获得结果的重现以及结果的变异情况 要点 A 确定适当的样本数 B 各组动物数目尽量相同 按动物类型确定样本数 1 小动物 计量 10例 计数 30例 2 中等动物 计量 8 计数 20例 3 大动物5 8例 第四节中药药理实验设计的注意事项 一 实验动物1 按要求选择不同级别符合医学实验标准的动物一级 普通动物 亦称常规动物或无疾病的动物 二级 清洁动物 饲养在温度恒定 普通设施中的动物 饲料 垫料 用具均经过高压消毒 三级 无特殊病原体动物 specific pathogenfree 简称SPF动物 在清洁级基础上还需不带干扰实验的微生物 在隔离室或层流室饲养 四级 无菌动物 机体内外均无任何寄生虫的动物 一般是临产前按无菌手术剖腹取出胎仔 在无菌条件下用无菌饲料繁养获得的动物 2 根据实验目的选择敏感种系心血管系统 大鼠猫 犬 小型猪等 体温调节 兔呕吐实验 鸽 猫或狗等 免疫调节 纯种小鼠原则 选择对药物的反应与人体相近的种系 3 性别 根据要求选择用一种性别比两种性别兼用所得结果离散度较小 4 年龄体重 每批动物的体重 年龄越接近越好通常 小鼠 18 22g 大鼠 200 25g 豚鼠 250 300g 兔 猫 1 5 2Kg 犬 10 15kg 大鼠 小鼠 6 8周龄 4 数量 计量研究 小鼠每组 10只大鼠每组 8只豚鼠或兔每组 6只猪或狗 5只计数研究 小鼠每组 30只大鼠每组 20只 5 习性 小鼠 大鼠均为群居动物 不宜单独饲养 二 受试药 1 制备情况 1 新药受试药要求 用处方固定 质量稳定 工艺 质控指标恒定后的中试产品 2 一般受试中药 生药经鉴定 科属种清楚 提取制备工艺明确 含量确 3 中药单体 化学结构式清楚 4 动物给药量 以g kg或mg kg生药量或有效组分含量表示 2 给药途径 实验的给药途径与临床拟使用的途径一致 中药粗制剂一般不用注射给药或体外实验的方法检测药物效应 3 给药时间 注明首次给药时间及每次给药的间隔时间 预防性给药 治疗给药 4 剂量 剂量组数 新药研究至少设3个剂量组 三者最好成等比 能反应量效关系 给药容量相等 浓度不等 合理选择剂量 1 参考LD50 在LD50的1 10 1 20 1 40等范围内设置高 中 低剂量组 2 根据临床用药等效量计算 不同种类动物等效用药量的计算 应用举例 某复方的总药量是60g 剂 每天1剂 按实验动物与人用药量折算表计算 200g重大鼠等效量是多少 按g kg计算 200g重大鼠等效量为 60g 0 018 1 08g 只 或 60g 56 1 07g 只大鼠每公斤的给药量是 1 08g 1000 200 5 4g Kg 人的每公斤体重给药量为 60g 70 0 857g Kg 按体重计算 要达到等效 大鼠的剂量应为人用剂量的5 4g Kg 0 857g Kg 6 3 倍 如同一复方要用小鼠实验 小鼠每只的给药量为 60 0 0026 0 156g 只 0 156 1000 20 7 8g Kg 按体重计算 要达到等效 小鼠的剂量应为人用剂量的7 80g Kg 0 857g Kg 9 1 倍 豚鼠应用量为60 31 5 1 90g 只 1 90 1000 400 4 762g Kg 按体重计算 要达到等效 豚鼠的剂量为人用量的4 762 0 857 5 56 倍 兔 60 14 2 4 225g 只 4 225 1 5 2 816g Kg 按体重计算 要达到等效 兔的剂量应为人用量的2 816 0 857 3 287 倍 狗用量为60g 3 1 19 35g 只 19 35 12 1 61g Kg 按体重计算 要达到等效 狗的给药量应为人的1 61 0 857 1 88 倍 根据不同种类动物等效用药量表练习 某利尿中药对250g重大鼠的有效量为240mg kg 试计算12kg犬的等效实验剂量 按mg kg计算 答案 240mg kg 4 60mg 只60mg 只 17 8 1068mg 只1068mg 只 12 89mg kg 噻嗪类 不同种类动物间用药剂量换算表 转换因子计算法 某利尿中药250g重大鼠的有效量为250mg kg 试计算15kg犬的等效实验剂量 犬的等效实验剂量 250mg kg 6 9 22 78 4mg kg 不同种类动物间用药剂量换算表 体表面积 kg体重比值法 某利尿中药250g重大鼠的有效量为250mg kg 试计算15kg犬的等效实验剂量 犬的等效实验剂量 250mg kg 0 16 0 47 85 1mg kg 按体型分数换算法 采用下列公式 式中dB是欲求算的B种动物 包括人 的kg体重剂量 dA是已知A种动物 包括人 的kg体重剂量 WA WB是已知动物A B的体重 RA RB是动物的体型系数 动物与人的体型系数 例 已知家兔2kg 用药50mg kg 求算家犬5kg体重的用药量 dA 50 RA 0 093 RB 0 104 WA 2 WB 5 代入上述公式 3 根据文献估计剂量如有相关的药物 相似的复方 其使用剂量可作为参考 4 通过预试估计剂量 5 给药容量 小鼠口服 0 1ml 0 25ml 10g最大不超过0 4ml 10g其他途径不超过0 25ml 10g 大鼠口服 10ml kg 不超过2 0ml 100g其他途径不超过1 0ml 100g 药物溶液配置 例 戊巴比妥钠对小鼠腹腔注射的有效麻醉剂量为40mg kg 现有体重为20g左右的30只小鼠要麻醉 试问要称量多少克的戊巴比妥钠 设计的给药容量为多少 配成怎样浓度 药物溶液配置 答 20g左右的30只小鼠总体重600g 40mg kgx0 6kg 24mg24mg 4mg ml 6ml称量戊巴比妥钠30mg 加生理盐水至7 5ml 使浓度为4mg ml 小鼠腹腔注射0 1ml 10g 即10ml kg 三 对照药 合法性 中国药典 收载或符合部颁标准 或新批准合法生产的药物 可比性 其功用 主治 剂型 给药途径 与受试药相似 特殊情况下 在合理范围内可适当灵活掌握 择优选用 有多种同类药可供选用时 应择优选用公认疗效较好的药物 选择的阳性对照药要注意有无批准文号 如 麝香保心丸 国药准字Z31020068生产单位 有效期 必须用有效期内产品 恬尔心注射用 国药准字 2001 J53号 进口药品注册证号 BX20010122 四 实验条件控制 时辰 动物生理活动有其昼夜节律 如小鼠夜间活动增加 白天活动减少 最好每批实验在每天相同的时间测定 环境温度 室温稳定 适宜 饮食 有些实验需对动物禁食 预适应 3 7天 五 数据表达和常用统计分析的注意事项 一 数据表达和精确度 一般应至少有3位有效数字 标准差至少有2位有效数字 均数的小数位数应与标准差相同 出示的结果应包括均数 标准差 例数 P值情况 0 05 或具体P值 数字的精确度要与测量仪器所能达到的精确度一致 表5增液汤 四逆汤对腹主动脉不完全结扎致心室重构大鼠动脉血压的影响 与模型组相比 P 0 05 P 0 01 二 极端数据 outliers 的处理 避免差错形成极端数据 对可疑数据及时复测或复核 及时纠正差错 在x 3s之外数据 可考虑舍弃 否则不应随便舍弃 根据 新药 西药 临床药研究指导原则汇编 药学 药理学毒理学 一组数据按正态分布时 x s内的数据占68 27 x 1 96s内的数据占95 0 x 2 58s内的数据占99 0 三 数据统计分析应避免的差错 1 量反应资料 1 两组间实验结果比较常用t检验 unpairedttest df n1 n2 2 T值计算公式 通式 下列情况两组间比较不能使用t检验 方差不齐改用校正t值法 即t 检验 方差齐性检验 如两组的标准差相差一倍以上时 基本可判断为方差不齐 通过计算 当F F0 05时可判断为方差不齐 F s12 s22F0 05 1 2 8 n1 14 n2 3 式中S较大者为S1 n1 较小者为S2 n2 F0 05也可通过可查 方差齐性检验F值表 获得 注 与 方差检验F值表 不同 如 有两组数据 需统计有无显著差异 甲组 11 5 14 1 12 3 10 8 13 0 13 2 13 912 3 10 6乙组 10 0 11 9 12 0 12 8 14 9 17 4 19 3 20 2 23 1计算x1 s1 12 41 1 26 n 9 x2 s2 15 73 4 48 n 9 查无应舍数据 有无方差不齐 F 4 482 1 262 12 64F0 05 1 2 8 9 14 9 3 4 422F F0 05说明两组方差不齐 用t 检验 方差不齐时的校正t 值计算公式 甲组 11 52 1 26 n 9 乙组 15 73 4 48 n 9 按上式计算t 2 142 相应自由度界值近似值的计算公式如下 t 上式中t 1 为自由度为n1 1时的界值 t2 为自由度为n2 1时的界值 当t 当前的绝对值大于或等于上述界值时 P t 0 05 本例自由度 n1 1 及 n2 1 均为 9 1 8 查表得t0 05的界值为2 306 代入公式计算得t 0 05 两组间比较无显著性差异 2 306 甲组 11 52 1 26 n 9 乙组 15 73 4 48 n 9 按上式计算t 2 142 但以 t 检验 上述两组数据f 9 9 2 16f 16时t0 05 2 120 将得出 P 0 05 两组数据有显著差异的错误结论 EXCEL软件T检验过程 选中fx TTEST 显示填写框 Array1A1 A9Array2B1 B9Tails2TypeArray1为第一个数据集 Array2为第二个数据集 Tails指示分布曲线的尾数 如果tails 1 函数TTEST使用单尾分布 如果tails 2 函数TTEST使用双尾分布 Type为t检验的类型 1 成对检验2 等方差双样本检验3 异方差双样本检验上列Type填 2 时p 0 045993Type填 3 时p 0 57358 数据明显偏态时 不能用 t 检验 不用x s表达 改用中位数检验 用非参数统计法 如Mann Whitney秩和检验 等级和检验 序值法等 偏态简便判断法A 如均数两侧例数之差大于2 n时不用检验 即可判断为明显偏态 例1 一组数据是否正态分布 15 1 17 9 18 2 14 3 16 5 19 7 18 6 17 4 18 1 40 8 38 9分析 x s 21 41 9 26 n 11 均数左边9位 右边2位 均数两侧例数之差为7 2 11 6 63 上述一组数值为偏态 不可用正态检验 偏态简便判断法B 用公式R 4 n D2 D为均数两侧例数之差 n为例数 如R为负 表示数据肯定为偏态 如上述一组数据 R 4 11 7 7 5 表示数据肯定为偏态 例2 一组数据总数为50例 大于均数35例 小于均差15例 是否为正态分布 R 4 50 35 15 2 200 400 200 此组数据为偏态 如有不定值 如 30 10等 不用t检验 改为中位数表达 用非参数统计法 如Mann Whitney秩和检验 等级和检验 序值法等 2 配对资料t检验 pairedttest 适用情况 同一批受试对象试验前后的配对数据 同一批受试对象身体两个部位试验测得的数据 同一批受试对象用两种检验方法的测试的结果 检验方法 t s 如某次对中药提取物的降压实验结果如下 是否降压 1pKa 7 5006mmHg 用药前 12 0 14 0 13 0 18 0 16 0 15 0 15 0 19 015 3 2 4 n 8 用药后 10 0 11 0 13 0 16 0 13 0 14 0 13 0 17 013 4 2 3 n 8 两组直接进行组间比较 两者间并无显著差异 用药前 12 0 14 0 13 0 18 0 16 0 15 0 15 0 19 0用药后 10 0 11 0 13 0 16 0 13 0 14 0 13 0 17 0差值 2 0 3 0 02 0 3 0 1 02 0 2 0 x s 1 87 0 99 n 8 配对t检验 t 1 87 0 99 8 5 357p 0 01 F 7时 t0 05 2 565t0 01 3 499 但进行配对t检验时 要确信除待分析的因素外 其他可控条件一致 否则可分别取配对变化值或变化率 求均数及标准差 同时设对照组 同样处理后 再进行两组间的t检验 这样更能提高检验效率 例 某药给药2周前后血压变化如下 问该药有无降压作用 组1大鼠血压 x smmHg 给药前180165190200192158175185178给药后150140170160159130145153155变化302520403328303223计算 x s 29 0 5 93t 29 0 5 93 3 14 67f 9 1 8 t0 01 3 355p 0 01 在本例自身对照 自身前后配对 实验时 同一个体在经历一段时间后 如2周 即使不作任何处理 给药 所得指标也可能有变化 为鉴别该组血压变化是否为非药物因素引起 实验时宜设立一个平行对照组进行比较 这样就有实验组观察前后和对照组观察前后4组数据 可分别求出给药组和对照组的变化值 差值 或变化率及标准差 再进行两组间的t检验 如 组2大鼠血压 给对照液组 x smmHg 前175165195205150145180171176后160155185190145145171162165变化151010155099119 3 4 7配对t检验 t 9 3 4 7 3 5 936 f 9 1 8 t0 01 3 355P 0 01 两组原始值间比较 给药前 给药组 180 3 13 3 n 9 对照组 173 6 19 2 n 9 t 0 860p 0 05两周后 给药组 151 3 11 9对照组 164 2 15 8t 1 957p 0 05 两组差值组间比较 组1 给药前后差值 29 1 6 0组2 给对照液前后差值 9 3 4 7t 7 794f 16 t0 05 2 120t0 01 2 921p 0 01 3 方差分析 analysisofvariance ANOVA 有时用某药的不同剂量与同一对照组比较 并同时要分析不同剂量作用有无区别时 构成了多组均数的组间比较 此时常使用单因素方差分析 使用方差分析时 仍然要首先考虑各组样本是否符合正态分布 方差是否齐性 若符合 方可进行分析 计算F值 分析总体是否有差异 方差分析 F 组间方差 组内方差F 1时说明组间随机误差与组内随机误差接近 研究因素的作用不明显 F 1 说明组间变异 组内变异 方差分析即计算F值 并根据自由度 判断组间变异即研究因素引起的可能性有多大 确定P值 如p 0 05 再进行组间两两比较 使用方差分析的条件 各组样本是相互独立的随机样本 各样本符合正态分布 各处理组总体方差齐性 若符合正态分布 方差齐性 则进行综合比较 当F 0 05时 说明综合比较有显著差异 再进行组间两两比较 组间多重两两比较 常用LSD leastsignificantdifference t检验 或q检验 student newman keulstest 如一次实验多个组中有一个共同的对照组 所关心的是各实验组与对照组间的比较 而各实验组间并不需要相互比较时 宜选用Dunnett检验 Dunnett stest SPSS软件具有Homogeneityofvariances程序 可预先对多组间比较进行方差齐性检验 方差齐时采用LSD q或Dunnett检验法进行两组间比较 若方差不齐时可考虑作如下处理 1 通过数据转换可成正态分布时 先进行数据转换 如取对数 后再进行方差分析 2 采用非参数检验 如秩和检验 序值法等 计量资料统计方法的选择 2 质反应资料 又称计数资料 有时机体对药物的反应只有 是 或 否 两种 如用药后动物死与不死 翻正反射的存在或消失 某种病理症状 如惊厥 出现或不出现等 实验结果可以是百分比或自然比 其显著性检验一般采用卡方检验 22法 X2 有效无效总计有效率 甲药35 a 15 b 50 a b 70 乙药25 C 25 d 50 c d 50 总计60 A c 40 b d 100 n 四格表的自由度恒等于1 0 05的机率点界值为3 841 X20 05 两药作用无显著性差异 样本较小 两组总数 40例 或数据中有0或1时 不用卡方检验 而用精确概率法或简化直接概率法 例 使用甲药16例中5例出现不良反应 使用乙药16例无不良反应 两药有无区别 p p 16 16 5 27 5 0 11 16 32 0 0217注 上式为单侧概率值 当a b c d时 四格表内各种组合呈对称分布 单侧检验p值乘以2即得双则检验概率值 因而 本例双侧检验P 0 0217x2 0 0434 P 0 05 结论 乙药的