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植物医药基因工程研究进程 生物化工王庆宇 近10年来植物基因工程取得夸人瞩目的成就 如抗虫棉 彩色棉 抗虫玉米 大豆等 都已进入产业化和商品化阶段 迄今美国已批准50多例转基因产品商品化 1 4的耕地种植转基因植物 美国市场已有近4000种食品来自遗传工程体 据最保守估计全球生物技术市场近5年内将超过1000亿美元 除农业方面的成就外 转基因植物作为生物反应器生产医药产品更是表现出诱人魅力 如转基因烟草生产抗体 转基因土豆生产可食性疫苗等 前景十分广阔 本文综述植物医药基因工程研究进展 1植物医药基因工程的发现 植物医药基因工程是指把重组的编码药用活性多肽和疫苗基因导人植物 使转基因植物能够大量生产这些活性多肽和疫苗 它是工厂化农业或分子药田的有诱惑力的部分 这种策略不仅可以大大降低这些本来昂贵的药品的生产成本 而且简化了贮存方式 因此 在国际上植物基因工程研究的一个新发展趋势就是利用转基因植物生产药物 这方面的工作最早是1988年比利时PGS公司的科研人员做的 本意是想让烟瘾君子们不用抽烟而只需拿烟叶闻闻或放在嘴里咀嚼就可过烟瘾 以此减少尼古丁对人体的毒害 他们将一种神经肽的编码基因转入烟草 得到的转基因烟草表达出高产量的神经肽尽管他们的初衷未能实现 因为神经肽是通过血液运输起作用的 它在 口腔中会被降解掉 但却意外地找到一条利用转基困植物生产神经肽的途径 此后 其他科学家们纷纷加人这一领域的竞争并且成果纷呈 1989年美国斯格里普斯研究所利用转基困烟草高水平地表达了单克隆抗体 其表达量选叶子总蛋白量的1 3 根据计算 如果按照这种表达水平 美国只需将其烟草土地面积的1 用来种植这种转基因烟草 就可以产生出270kg的抗体 足以提供给27万癌症患者1年治疗之用 此外 美国Bio resoaces公司利用植物基因工程手段生产白细胞介素2 荷兰用转基因马铃薯生产人的血清蛋白 韩国用转基因烟草和番茄生产人的胰岛素 我国北京大学蛋白质工程与植物基因工程实验室已克隆了对早中期妊娠引产极为有效的天花粉蛋白的基因 并首次成功地在转基因烟草中表达了该基因 2转基因植物医药生物反应器的优点 迄今在世界范围内正在研究开发的医药活性多肽和疫苗估计在100种以上 多肽药物中有人胰岛素 人生长激素 HGH 干扰素 白细胞介素 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂 TPA 免疫球蛋白 Ig 心钠素 降钙素 红细胞生长素 EPO 尿激酶 超氧化物歧化酶 SOD 等等 疫苗有麻风杆菌疫苗 脑膜炎球苗疫苗 乙型肝炎疫苗 流感疫苗和人免疫缺陷病毒疫苗等等 以往 这些疫苗和活性多肽是从动物和微生物中获得 用植物生产医用活性多肚和疫苗比用动物和微生物生产具有更大的优越性 2 1植物细胞的全能性植物的组织 细胞或原生质体在适当条件下均能培养成一株完整的植物体 药物基因转化到植物细胞后可培育出药用植物品种 并稳定遗传 通过种植生产药物 2 2植物种植是最经济的蛋白质生产系统种植农业所需要的仅是阳光 来自土壤或肥料的矿物质营养及水 所以药用工厂化农业展现出的最吸人之处是它能廉价生产高价值的 供不应求的蛋白 这样的例子是植物已能够生产人血清蛋白 据计算 用普通方法生产1g抗体的成本为2000 5000美元 而用大豆生产1000g抗体只需100美元 2 3植物是能够大规模生产蛋白质的生产系统当人们期望相当大规模地生产某种蛋白时 植物系统表现出是一个比微生物或动物更理想的生产系统 而且 现代化农业机械化能够有效地收割和加工大量的植物材料 2 4用植物生产疫苗简单 方便用动物或微生物生产口服疫苗需要特殊的专业知识和特殊的贮藏条件 包括冷藏 这对于第三世界国家是困难的 这些生产系统还存在一些其他的弊端 例如 多数微生物培养系统需要昂贵的生产培养基 而且培养基需要特殊处理 以消除致病的有害生物 动物系统生产力低 养殖困难 繁殖慢 也需要保持无菌生产条件 如果用植物来生产疫苗 则克服了上述弊端 利用植物能够贮藏蛋白质于种子中这一有利条件 可以简单地 方便地生产 贮藏和发放疫苗同样 使疫苗能够在水果和蔬菜中表达也是目前研究的一个重要方向 2 5植物具有完整的真核细胞表达系统表达产物可糖基化 酰胺化 磷酸化 亚基可以正确装配等转译后加工过程 使表达产物具有与高等动物细胞一致的免疫原性和生物活性 2 6表达产物安全可靠表达产物无毒性和副作用 无残存DNA和潜在致病 致癌性 由于植物所具有的上述优势 所以分子药田农业的设想在80年代末一经提出 便成为人们竞相研究的热点 目前 科学家们在此领域已取得一定成绩 这主要表现在3方面 一是成功地用植物生产药用蛋白 二是成功地在植物中表达抗体 三是成功地用植物生产某些动物疫苗 3植物基因工程生产药用蛋白 3 1研究进展从90年代初开始植物医药基因工程的研究以来已经取得了可喜的进展 表现出诱人的魅力 迄今已获得的具有潜在产业化价值的转基因植物表达药物重组蛋白列附表 因此 植物生产药用蛋白质或酶类具有极大的商业价值 但是 该研究领域还处于开始阶段 技术等尚未完全成熟 本文结合近年来的有关研究 对植物生产药用蛋白系统整个过程所涉及的同题进行了讨论 3 2植物基因工程生产药用蛋白的程序植物基因工程生产药用蛋白一般包括目的基因的克隆 高效表达载体的构建 植物细胞的遗传转化 受体细胞的组织培养和植株再生 转化植株栽培 目标产品的分离纯化及纯度鉴定等 其中高效表达载体的构建十分关键 目前急需时空特异性表达的高效启动子和能够稳定遗传的载体系统 以解决目前存在的表达水平低和遗传稳定性差的问题 目前广泛使用的启动子是CaMV的35S启动子 载体系统主要有根癌农杆菌介导的 遗传转化系统和以病毒为载体的表达系统 前一系统主要转化双子叶植物 能够稳定遗传 但产量低 给转基因植物生产药用蛋白提出一个重要方向是将目的基因插入病毒基因组中 然后将重组病毒接种到植物叶片上 任其蔓延至所有叶片 外源基因则随病毒的复制而高水平表达 这样植物即成为生产该目标蛋白的 绿色工厂 利用这类方法有望生产较廉价的药用蛋白 近几年来一些实验室已在进行此类研究 美国科学家在TMV中插入指导合成血红蛋白和其他蛋白的基因 使用叶片切刀和眼药滴管把重组TMV引入烟草叶片 2周之内所有叶片即感染病毒 开始制造目标蛋白 这一技术开辟了新的领域 极有希望成为药用蛋白的主要来源和生产方法 当然 此 技术要拓宽其应用范围还应解决至少以下3个方面的问题 1 弱病毒株系的选择 要保证该病毒对植物的侵染不会使宿主植物生长异常 保证外源基因的插人不会使病毒失去侵染和复制能力 2 外源蛋白的纯化 用最简单的方法获取高纯度高活性的目标蛋白 以适于工业化生产 3 商业化生产还需解决农作物收获的季节性问题 降低收获 运输 贮存过程中的能源消耗和劳动力投入 4植物基因工程生产人抗体 随着PGS公司从烟草中表达神经肽的发现后 抗体基因在转基因植物中有效表达的研究日益多 出现了 植物抗体 这一新名词 它是指人或动物抗体基因或基因片段在转基因植物中表达的免疫性产物 目前这一领域的研究十分活跃 许多实验室已成功地利用植物表达系统产生出各种各样的抗体 并试图把抗植物病毒 真菌和细菌的抗体基因转人植物中表达 不仅可以获得抗病植物 而且可利用转基因植物生产抗体 中科院微生物所也已经克麈了抗RSV外壳蛋白的单链抗体基因现在正试囝转化到植物中去 4 1抗体的含义和结构功能抗体的化学本质是球蛋白 但并非所有血清球蛋白都是抗体 血清球蛋白包括 球蛋白 吨球蛋白 0球蛋白和球蛋白 其中具有抗体活性的蛋白质太部分为球蛋白部分为口球蛋白 少数为a1球蛋白 Atassi等 1988 只有这些与抗原特异性结合的球蛋白才可称为抗体 1964年世界卫生组织 WHO 将血清球蛋白的抗体部分命名为免疫球蛋白 immounoglobulin 简称Ig 在血清中有5类抗体 IgG IgA IgM IgD IgE 每一类均由重链 H链 和轻链 L链 组成 每个L链和H链均由一个可变区 v 和一个不变区 c 组成 不同类的H链不变区各不相同 但L链均相同 抗原结合部位是由L链和H链两者的可变区的超变片段的残基构成的 免疫球蛋白G IgG 是血清中的主要抗体 免疫球蛋白G的亚基结构是L2H2 150KD的IgG能被木瓜蛋白酶水解为2个50KD的活性片段Fab 其中Fab片段能与抗原结合 故被称作Fab 另一个片段称为Fc 它不与抗原结合 却介导效应物功能 如补体的结合等利用基因工程技术 可以得到不同的活性抗体片段 除了Fab和Fc外 还有FV SeFv和dAb Fv是由2条独立的多肽 VL和VH 组装而成 它具有一个完整的抗原结合位点 但它不是特别稳定 ScFr 即单链Fr Single chainFv 是单基因合成的产物 它由 条肽链把VH和VL连接在一起 所以是个更稳定的片段 在设计新的诊断和亲合试剂时 ScFv是增加活性的焦点 Dab属单结构抗体 Singledomainantibody 4 2完整抗体在植物中的表达4 2 1抗体在转基因烟草中表达在过去的几年里 国际上有几个研究小组已经开始研究完整的抗体分子在植物中的表达 其中 Hiau等首先报道了在植物中表达重组抗体6D4的研究情况6D4属于I 它具有结合一种合成磷酸酯一P3的功能和催化某些羧酸酯水解的作用 他采用两步的策略表达免疫球蛋白 第一步 他们用CaMV35S启动子调控下的编码重链和其信号序列的基因或编码K轻链和其信号序列的基因分别转化烟草 分别获得表达重链或轻链的转基因植株 除此之外 他们还用切除了信号序列的编码重链或轻链的基因转化烟草 第二步 他们把表达重链的转基因植株和表达轻链的转基因植株杂交 获得表达完整抗体6D4的植株 对第一步获得的转基因植株进行分析 发现只有表达未经修饰的编码全长的重链或轻链的基因的转基因植株中有免疫球蛋白的积累 相反 虽然在表达编码切除信号序列的重链或轻链的基因的转化植株中可以检测到一定水平的转录体 但是这些植株明显地不累积免疫球蛋白 这一结果表明 免疫球蛋白的信号序列对于蛋白质的累积是必要的 第二步获得的既表达轻链又表达重链基因的F1代转基因植株能够产生装配好的完整抗体 其表达量高达植株总蛋白的1 而且这种抗体和杂交瘤 Hybridoma 来源的抗体对于P3的亲合性是一样的另外他们还发现 F1代转基因植株中的免疫球蛋白的表达水平高于其亲本表达单链的水平 这表明两条链的共表达提高了 单链表达的水平 而且链的装配提高了其稳定性 在F1代中的表达修饰过的免疫球蛋白的基因的转基因植株中也未能检测到装配的抗体 内质网 ER 对于链的装配及稳定是必需的 在产生抗体的B细胞中 重链和轻链的复合体的装配是在ER中进行的 有两种蛋白参与了这个过程 一是催化形成二硫键和二硫化合物异构酶 DisulphideIsomerase 另一是结构类似于hsp70的重链结合蛋白 BiP 植物细胞的ER腔中具有二硫化物异构酶和BiP的相应物而细胞质中却不具备 因此 修饰基因产生的肽链 由于不具备信号序列 所以不能定位到ER 从而不能装配 稳定性也很差 4 2 2抗体在转基因拟南芥菜中表达 最近DeNeve等 1993 报道了抗体 IgGI 及其Fab片段在拟南芥菜和烟草中的表达 尽管2种植物表达出的抗体和Fab都具有抗原结合能力 但它们的表达量有明显不同 Fab在烟草中的表达量为叶片总蛋白量的0 04 而在拟南芥菜中的表达量则为1 3 另外 免疫印迹实验表明 在转完整抗体基因的拟南芥菜中 含有150KD的完整抗体 而烟草则含有丰富的50KD抗体片段 这说明2种宿主组装抗体的形式也有差异目前对这些现象的产生机制还不清楚 可能与植物本身的特性有关 4 2 3抗体基因在植物愈伤组织细胞中的表达愈伤组织细胞作为去分化细胞也能够有效表达抗体及其功能片段 Hein等 1991 Owen等 1993 为了研究抗体分子在植物细胞内表达后的命运 Hein等在禽伤组织细胞培养中掺人同位素S 结果表明 大部分抗体分子在合成之后 通过细胞膜和细胞壁而被分泌到培养基中 其浓度可达20mg L 4 2 4抗植物病毒单链抗体在转基因植物中的抗病作用最近 意大利学者 Tavladorakl等 1994 把抗菊芋斑皱病毒 antichokemottledcrinklevrius 简称AMCV 的单链抗体基因转入植物体内 使转基因植物不仅表达了抗体蛋白而且还获得了对植物病毒AMCV的抗性 这一结果说明动物免疫系统中的抗体同样能够在转基因植物细胞内发挥中和病毒的作用 在植物基因工程细胞内免疫作用的成功范倒为生产新的抗病植物带来了希望 同时基因工程抗体还将作为一种有利工具用于研究病毒与植物的相互关系 4 3抗体片断在植物中的表达科研人员的研究结果表明 转基因烟草植株在其细胞中能产生具有功能的抗体片段 Benvenuto等把编码一种鼠IgG的VH结构域和Erwinia的果胶裂解酶前导序列的融合基因导人烟草 获得的转基因植株表达VH结构域多肽 其表达量高达可溶性蛋白的1 该抗体片段主要在植株的细胞内累积 4 4存在的问题最研究方向 1 尽管许多研究结果已经证明抗体及其片段能够在植物中进行有效表达 然而其表达水平尚不尽人意 这要通过基因工程手段 对植物表达系统加以改造 可使其能够高效表达符台临床需要的抗体 2 有资料表明 中和病毒的外壳蛋白需要过量的抗体Saunal等 1993 在体外研究中发现 单克隆抗体与烟草花叶病毒外壳蛋白按50 1的摩尔浓度孵育18h 才出现抗体对TMV的抑制作用 由此可见通过抗体直接中和病原物而达到植物抗病的目的显然是困难的 因此 抗体在植物抗病方面的应用可能将通过另一种较为理想的途径 即利用抗病原微生物中非结构蛋白的抗体转化植物 例如 在植物中表达能中和与病毒复制或组装有关的酶的抗体后者不需要很高的浓度就可能有效地干扰病毒的复制 3 由于动植物遗传背景的差异可能会造成抗体成分的不同 例如植物抗体重链教基末端碳水化台物残基与哺乳动物不同 因此尚需评价植物来源的抗体对人体的免疫原性问题 4 抗体作为植物抗病因子是否能在适宜的时间和部位进行适量的表达 5 抗体是动物体液免疫系统中的防御分子 其功能是通过免疫系统中补体及细胞因子协同作用完成的而植物的防御系统缺乏这些物质因此即使抗体能中和致病因子 如果不能进一步消化和清除 这些免疫复台物在植物体内积累是否引起植物体内的过敏反应 妨碍植物的防御功能和正常代谢 6 由于抗体的特异性比较单一 即一种抗体只能中和一种或一类结构相似的病原微生物 而大田中分布的病原体是多样和高频率变异的 因此抗体作为植物抗病策略在实际应用中还存在许多有待解决的问题 5植物基目工程生产疫苗 近10年来 随着基因工程技术的进步 疫苗研究领域异常活跃 基凼工程单克隆疫苗 活载体疫苗 核酸疫苗等各展风姿 让人应接不暇 转基困植物疫苗也悄然而起 并以其独具的特也 可食 饲 性 展现了诱人的潜在开发价值 利用转基周植物生产基围工程疫苗是当前的一大热点 也是人们十分关心的问题 5 1植物基因工程生产人可食性疫苗迄今对不耐热的肠毒素B LT B 转基因植物的研究相对较多 效果也较好据Hag等报告 用LT B基因转化的烟草和土豆 其外源基因均能获得表达 井有较好的免疫原性 在他们的试验中最大表达量 烟草为每g可溶性蛋白5 g 土豆块茎为每g可藩性蛋白30 g 用烟草叶浸提物口服免疫的小鼠 在0 4 21 25d灌服 每次约含药量12 5 g重组LT B蛋白 在免疫后30 32d时采集血清和粪便 检测血清lgG和粘膜lgA抗体价与有同剂量细菌性LT B灌服的免疫小鼠完全一致 在同样时间直接饲喂转基因土豆 每次5g含15 20 gLT B 也都产生血清lgG和粘膜IgA 但与每次灌服20 g细菌性LT B小鼠相比 抗体浓度较低 笔者认为这一现象是由于生饲土豆中有限制或干扰重组蛋白与肠粘膜淋巴组织反应的因素存在 但据Mason等报告 每周饲喂小鼠1次 每次5g土豆 约含20或50grLT B 第3次饲喂后1周 血清IgG和粘膜lgA抗体水平高于灌服5 g细菌性LT B的小鼠 而且口服25 gLT进行攻击试验时 饲喂试验组虽没有1只小鼠被完全保护 但免疫保护效果也优于灌服5 g细菌性LT B的对照组 Taekef等在自愿者人体进行了生食LT B转基因土豆免疫试验 参试14人 分低 高剂量组 分别于O 7 21d食用3次 每次低剂量组食用50g转基因土豆 高剂量组为100g 每克土豆含3 7 15 7 grLT B 结果表明食用7d后在血循环和类便中即可部分检出IgG和IgA特异性抗体 并证明有中和活性 血清IgG持续时间较长 食后59d时 有的个体仍在上升 血清lgA在食后28d达高峰 而粪便IgG在7 14d达高峰 粘膜抗体检出率也比血清抗体低 粪便I异A柱出率为50 血清IgG为91 lgA为55 由此可见 对食用转基因LT B疫苗的反应 个体间存在显著差异此外 还初步发现增加食用土豆剂量2 3倍 Antzen等在转基因烟草表达HbsAg疫苗的基础上 现在用莴苣和香蕉做试验 准备制造 乙型肝类疫苗色拉 和 可食香蕉乙型肝炎疫苗 并预期在2年内达到临床试验阶段 并没有相应的增强免疫反应的作用 5 2植物基因工程生产动物可食性疫苗在动物疫苗的研究同样取得可喜的成果 Carrillo等 1998 用口蹄疫病毒VPI基因也获得了转基因芥菜 用含有rVPI的时浸提物免疫小鼠 可诱导产生特异性抗体这种抗体不仅能与VPI发生反应 而且也能与完整的口蹄疫病毒颗粒反应特别令人鼓舞的是 所有免疫小鼠都抵抗了口蹄疫病毒强毒的攻击 到目前为止 这是关于转基因植物表达的病毒抗原使免疫动物全部获得保护的首篇报告 遗憾的是也未进行口服免疫试验 5 3植物基因工程生产疫苗的问题和前景转基因植物可饲 食 疫苗的研究还处在刚刚起步阶段 尽管有人已经或正在进行人体试验 但距离实际应用还有很大距离 许多问题尚需深人研究 5 3 1需要解决增强转基因植物可饲 食 疫苗的免疫原性的问题在Tackef等报告中 生食土豆的受试者仅有50 可捡出粘膜分泌性IgA 在Mason等的小鼠试验中 饲喂转基因土豆的鼠 ELISA检测IgA抗体阳性率只有