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常见微生物培养检测技术 细菌培养方式 用人工方法 将细菌从自然界 动物体或病料中分离出来 研究细菌的形态 生理特性 生物学特性或制取细菌的某种代谢产物等 这对于传染病的诊断和防治具有重要意义 根据不同标本及不同培养目的 可选用不同的接种和培养方法 常用的有分离培养和纯培养两种方法 一 培养基的种类和常用培养基 培养基的概念 将细菌所需的各种营养物质按一定比例混合在一起 并调节到适宜的PH 这种人工配制的适合细菌生长繁殖的细菌营养物 称为培养基 培养基配制原则 培养基组分应适合细菌的营养特点营养营养协调理化条件适宜经济节约无菌 1 培养基的种类 按培养基的组成成分分类合成培养基 天然培养基按培养基的物理状态分类液体培养基 半固体培养基 固体培养基按培养基的功能分类基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基 厌氧培养基 1 基础培养基 含有培养一般细菌的最基本成分 又分为 液体培养基 固体培养基和半固体培养基三种 在液体 肉汤 培养基中 加入2 3 琼脂即为固体培养基 加入0 2 0 5 琼脂即为半固体培养基 2 营养培养基 于基础培养基中加入高营养物质如葡萄糖 血液 血清 腹水 生长因子等 以满足营养要求较高的细菌生长需要有的细菌还需加入特殊物质 如结核杆菌需加入鸡蛋清 马铃薯 甘油等才能良好生长 3 选择培养基 利用细菌对某种物质敏感程度的不同 可在培养基中加入抑制某些细菌生长的药物 而选择性地让欲分离的细菌旺盛生长的培养基 如胆盐和蔷薇色酸可以选择性地抑制G 菌的生长 而不影响G 菌的生长 在培养基中加入二药后可选择性地分离出肠道杆菌 4 鉴别培养基 利用细菌分解底物及其代谢产物的不同 可在培养基中加入某种物质和指示剂 即制为鉴别培养基 以测定不同细菌的生化反应 紫黑色 具有金属光泽的菌落 麦康凯平板 红色菌落 5 厌气培养基 将培养基与空气及氧隔离 或降低培养基中的氧化还原电势 供厌氧菌生长 除去培养基中氧的方法 降低培养基中氧化还原电势 如肝汤或加入谷胱甘肽 硫基醋酸盐等 化合去氧法 如焦性没石子酸 好氧厌氧菌混合 种子发芽等 隔绝阻氧法 如液体石腊等 二 细菌在培养基上的生长特征 有关概念菌落 在固体培养基上 由单个细胞繁殖形成的肉眼可见的细菌集落 称为菌落 菌苔 在固体培养基上 大量菌落密集生长 融合成一片 称为菌苔 纯培养 挑取一个菌落到另一培养基桑培养 称为纯培养 不同的微生物种类 其菌落特征不同 同一种菌在不同培养条件下菌落特征也不尽相同 细菌的生长特征有助于细菌的鉴定 细菌分离培养形式及培养结果 细菌细胞壁的主要成分是 肽聚糖 peptidoglycan 又称为粘肽 mucopeptide 或胞壁质 murein 丹麦病理学家革兰 HansChristianGram 为证实病组织切片中有细菌存在 在1884年介绍了脱色后再进行复染的鉴别染色法 后来被称为革兰染色法 通过革兰氏染色法可将细菌分为G 菌 蓝紫色 和G 菌 红色 两大类型 主要区别在于细胞壁结构不同 致病菌的检验程序 细菌药敏试验结果 同一细菌对不同抗生素的敏感性 不同细菌对相同抗生素的敏感性 病毒 病毒 Virus 是形体微小 结构简单 仅含有一种核酸 DNA或RNA 能够通过细菌滤器 具有超级寄生性 严格的细胞内寄生 且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形微生物 1892年 伊万诺夫斯基和贝杰林克 烟草花叶病毒 开创了病毒学独立发展的历程 没有细胞结构可以透过细菌滤器只含一种核酸 DNA或RNA 严格细胞内寄生增殖方式为核酸复制对干扰素敏感 对抗生素不敏感 病毒的基本特征 一 病毒的感染病毒与细胞相互作用称为病毒的感染 1 溶解性相互作用 病毒增殖 宿主细胞被破坏或溶解 也可不破坏细胞 形成稳定状态感染 2 转化性相互作用 病毒基因组与宿主细胞基因组整合 引起宿主细胞发生转化 有些非但抑制宿主细胞的生物合成 反而促进细胞分裂增生 导致肿瘤或细胞癌变 病毒的增殖 二 病毒的增殖病毒自身无完整的酶系统 不能进行独立的物质代谢 必须在活的宿主细胞内才能进行生活 复制和增殖由宿主细胞供应原料 能量和生物合成场所 在病毒核酸遗传密码的控制下 于宿主细胞内复制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白质 进一步装配成大量的子代病毒 并将他们释放到细胞外 这种增殖方式称为复制 病毒的复制周期 ReplicativeCircle 定义 自病毒吸附于细胞开始 到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程称为病毒的复制周期 病毒的复制增殖过程 大致包括吸附 穿入 脱壳 生物合成 装配和释放六个步骤 Replicationofvirulentphage Lysogenicinfection 1 吸附 需要病毒表面特异性的吸附蛋白 VAP 与细胞表面受体 也称为病毒受体 相互作用 是决定感染成功与否的关键环节 细胞膜受体有脂蛋白受体和粘蛋白受体两种 除具有病毒吸附部位外 尚有促进病毒感染的作用 病毒的细胞受体具有种系和组织特异性 决定了病毒的宿主谱 2 穿入 侵入 病毒吸附于细胞膜后 细胞膜受体和邻近部位的膜发生折叠 将病毒吞陷 吞饮于泡内 牛痘病毒 或通过病毒与宿主细胞膜的融合进入细胞浆中 疱疹病毒 无包膜病毒则直接穿过细胞膜而入细胞 呼肠孤病毒 直接进入 裸露病毒 膜融合 包膜病毒 胞饮 包膜病毒 3 脱壳 感染性核酸从衣壳内释放出来的过程 有包膜病毒脱壳包括脱包膜和脱衣壳两步 无包膜病毒只需脱衣壳 方式随不同病毒而异 病毒衣壳的脱落和核酸的逸出 主要在细胞浆 RNA病毒 或细胞核 DNA病毒 内完成 4 生物合成 病毒进入宿主细胞后生物合成阶段 胞浆中无病毒颗粒 称为隐蔽期 eclipse 病毒的生物合成过程分早期和晚期两个阶段 1 早期 主要是由核酸 DNA或RNA 通过mRNA制造酶类蛋白质代谢工具和核酸基因组需要的核苷酸原料 2 晚期 主要是通过晚期mRNA合成病毒结构蛋白质 5 装配 多数DNA病毒在细胞核内合成装配 RNA病毒在细胞浆内合成装配 6 释放 有的病毒聚积在细胞空泡内后通过细胞通道向外溢出 有的依靠细胞膨胀破裂放出 有的则因细胞感染病毒后死亡裂解或自溶而释出 有囊膜的病毒多数借出芽而穿出细胞游离 一 动物接种 动物选择标准 对病毒的易感性高 动物健康 体重 年龄尽可能一致 最好使用相应的等级实验动物 并符合所要培养病毒的要求 尽量使用遗传特性相似 个体差异较小 生物学反应比较一致的动物 外购动物 接种前要经过健康观察 以免误用带有病原体动物 可根据病毒性质 材料性质和目的不同 采取皮下接种法 皮内接种 肌肉接种 静脉接种 腹腔接种法 脑内接种法 二 禽胚培养 理想的禽胚为SPF鸡胚 常用非免疫鸡胚加以补充 这种蛋应无特定病原的母源抗体 否则会影响病毒在胚内增殖 此外 不同病原对禽胚的适应性也不同 如狂犬病和减蛋综合征病毒在鸭胚中比鸡胚中更易增殖 鸡传染性喉气管炎病毒只能在鸡和火鸡胚内增殖 实际应用时而加以严格选择 常用的接种途径有绒毛尿囊膜法 尿囊腔法 羊膜腔法和卵黄囊法四种 根据不同的病毒和不同的目的采用适宜的接种途径 绒毛尿囊膜接种 10 13日龄胚 尿囊腔接种 9 11日龄胚 羊膜腔接种 10 12日龄胚 卵黄囊接种 5 8日龄胚 禽胚接种术式 鸡胚不同接种途径与收获比较 影响禽胚病毒增殖的因素 1 种蛋质量 SPF种蛋最理想 其次是非免蛋 普通种蛋不能用 病原微生物 家禽有很多疫病可经垂直传递于鸡胚 这些病原体既可污染制品本身 又可影响接种病毒在鸡胚内增殖母源抗体 种蛋带有母源抗体 影响病毒在鸡胚内增殖抗生素 家禽混合饲料中常含有一定的抗生素 这种微量的抗生素可以传递给蛋胚残留 2 孵化技术 适宜的孵化条件有利于病毒增殖温度 通常适宜温度为37 39 5 宁低勿高 湿度 鸡胚孵化标准为53 57 水禽胚孵化比鸡胚高5 10 通风 发育过程中吸入氧气排出二氧化碳 随胚龄增长需更换孵化机内空气 转蛋 大头向上垂直放置入孵 在孵化过程中定期转蛋 使胚胎受热均匀 防止胚胎与蛋壳粘连3 接种技术 不同病毒的增殖有不同的接种途径 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同 同时 接种操作应严格按照规定 不应伤及胚体和血管 以免影响其发育 使病毒增殖速度降低或停止 细胞培养从广义上讲是体外培养之一 体外培养包括器官培养 组织培养和细胞培养 器官培养常指对未分散组织进行培养 可保留部分或全部组织在机体中的组织形态 组织培养是指从体内取出组织 模拟体内生理环境 在无菌 适当温度和一定营养条件下 使之生存和生长 并维持其结构和功能的方法 细胞培养是指利用机械 酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2 4个细胞团悬液进行培养 根据培养细胞的染色体和繁殖特性 细胞可分为三类 即原代细胞 细胞株和细胞系 三 组织培养 多数病毒在敏感细胞增殖可引起细胞代谢等方面的变化 发生形态改变 如变圆 拉长 聚集和融合等即细胞病变 CPE 但也有些病毒在细胞上增殖不产生CPE 显微镜下细胞病变形态特征主要为 细胞圆缩 如痘病毒 呼肠孤病毒 披盖病毒等 细胞聚合 如腺病毒 细胞融合形成合胞体 如副粘病毒 疱疹病毒 轻微病变