羟基蛋氨酸铁(铜、锰、锌)螯合率的测定长沙兴嘉生物工程有限.doc

羟基蛋氨酸铁(铜、锰、锌)螯合率的测定 长沙兴嘉生物工程有限公司质检中心氨基酸微量元素螯合物的生物利用率比无机离子的利用率高23倍，使用氨基酸微量元素螯合物是解决过量添加无机盐造成环境污染这一难题的有效方法，同时也防止了无机盐产生的不良影响及对维生素的拮抗作用。但氨基酸微量元素螯合物在饲料生产中应用还比较滞后，其原因除了价格因素外，缺乏合适的质量检测方法，也是推广应用的一个重要障碍，目前在产品标签保证值中大多仅明示矿物元素和氨基酸的百分含量，用户无法客观地评价螯合物产品质量。本研究旨在为羟基蛋氨基酸螯合物的质量检验提供一种简便实用的方法。1 原理试样经加热溶解、离心分离，分成沉淀态螯合元素、可溶性螯合元素及游离态金属离子。可溶性螯合元素及游离态金属离子经过凝胶色谱，在规定条件下洗脱，实现可溶性螯合态金属元素和游离态金属离子的分离，从而可分别测得螯合态金属元素和游离态金属离子的含量，分别用原子吸收光谱法测定沉淀态螯合元素、可溶性螯合元素及游离态金属离子的含量，即可计算出相应的氨基酸螯合物的螯合率。2 试剂和材料实验用水应符合GB6682中三级用水的规格，使用试剂除特殊规定外，均为分析纯。2.1 克拉克鲁布斯（Clarklubs）缓冲溶液的配制 2.1.1 pH7.0的克拉克鲁布斯（Clarklubs）缓冲液的配制 分别量取1.0mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀释至刻度。2.1.2 pH9.0的克拉克鲁布斯（Clarklubs）缓冲液 分别量取20.8mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀释至刻度。 2.1.3 pH10.0的克拉克鲁布斯（Clarklubs）缓冲液 分别量取43.7mL氢氧化钠(0.1mol/L)溶液,12.5mL硼酸(0.4mol/L)溶液，12.5mL氯化钾(0.4mol/L)溶液，注入100mL容量瓶，稀释至刻度。 2.2 乙二胺四乙酸二钠溶液C(EDTA)=0.1mol/L。 称取37.2g乙二胺四乙酸二钠加热溶于100mL水中。 2.3 葡聚糖凝胶（G-15） 2.4 盐酸（1+10）3 仪器 3.1 恒温水浴锅 3080可调 3.2 原子吸收分光光度计 波长范围190900nm 3.3 离心机 转速能达到3000r/min。 3.4 色谱柱3009mm4 测定步骤 4.1 试样预处理称取试样约0.5g，精确到0.0002g，置于25mL离心管中，加入15mL水，于60水浴中，加热30min，不时搅拌，使试样充分溶解，于2500r/min离心10min。将上清液小心移入25mL容量瓶中，沉淀用4mL3热水（60）洗涤，离心，上清液一并移入25mL容量瓶中，定容，得可溶性螯合态金属元素溶液，称为A液。沉淀用10mL盐酸溶液（2.4）溶解，转入25mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得沉淀态螯合态金属元素溶液，称为B液。4.2 凝胶色谱柱的制备称取约10gG-15凝胶，配制成适当粘稠的悬浮液，静置3h，沿玻璃棒将排尽气泡的凝胶悬浮液一次倾入色谱柱内，待凝胶全部倾入柱内后，开启柱下面的出口开关，流出液体，使凝胶自然沉降。控制凝胶部分长度在1520cm。开启柱下部出口开关，用约50mLpH7.0的洗脱液洗涤凝胶色谱柱。4.3 上样排出洗脱液至凝胶表面近于流干，关闭出口开关；用移液管移取0.2mL溶液A，吸管口离床表面约1mm，小心加入样品液，使之均匀渗入床表面；打开出口开关，使样品流入凝胶床，用少量洗脱液小心洗涤柱壁周围及残留在床表面的样品；注入洗脱液，测定Cu、Fe、Zn的螯合物时，用pH9.0硼酸洗脱液；测定Mn的螯合物时，用pH10.0硼酸洗脱液。4.4 洗脱分离用相应pH的洗脱液洗脱，流速为0.7mL/min，收集洗出组分约100mL，定容至100mL，得可溶性螯合金属元素溶液，称为C液。可溶性螯合金属元素分离完成后，在凝胶柱顶端用吸管移入1mL EDTA(2.2)溶液，用pH7.0硼酸洗脱液继续洗脱，合并所有洗出组分，定容至100mL，得游离态金属离子溶液，称为D液。5 测定将上述A液、B液、C液、D液稀释至一定浓度（稀释倍数视含量而定），按GB/T13885上机测定，分别测定溶液中金属元素的含量。6 螯合率的计算 氨基酸螯合物螯合率按式(1)计算：X= (1)式中：X氨基酸螯合物螯合率%； ma、mb、mc、md分别为A、B、C、D溶液中金属离子的含量(ug/mL)； Va、Vb、Vc、Vd分别为A、B、C、D溶液的体积(mL)。7、结果及讨论7.1.凝胶树脂的选择选用的凝胶树脂应是惰性的、不与溶质分子发生反应，可反复使用不改变其凝胶性能；尽可能低的电荷，以免发生离子交换反应；足够高的机械强度。因此，我们选用葡聚糖凝胶树脂。本实验是进行组分分离，对于分配系数差别较大的物质的分离，通常选用交联度大的葡聚糖凝胶树脂。根据被分离物的分子量，我们选用G15葡聚糖凝胶树脂。7.2.洗脱条件的选择7.2.1 流动相的选择本实验中流动相的作用是推动被分离物质通过色谱柱，此时各组分的通过色谱柱移动的速率因分子的大小不同而各异，因此，流动相应选用不与被分离物质反应的惰性水溶液。本实验选用克拉克鲁布斯（Clarklubs）缓冲溶液即硼酸-氢氧化钠-氯化钾组成的缓冲体系。7.2.2 洗脱液pH的选择配制不同pH值的硼酸缓冲液作为洗脱液，吸取铁、铜、锰、锌标准溶液并调整其pH，分别过柱，洗脱、定容得C液。加入EDTA溶液，用pH=7的缓冲液作为洗脱液，洗脱，得D液，分别测定C液、D液中金属离子浓度，测定过柱后的溶液回收率。以确定分离可溶性螯合元素及游离态金属离子的最佳pH。 表1 不同pH值时的分离效果（以回收率表示%）项 目ph值6.06.47.07.48.08.49.09.410.010.4FeC液40.67.83.91.500001.02.5D液60.192.696.398.9100.299.8100.9100.699.198.5CuC液20.911.83.61.10.800002.0D液80.388.696.899.299.3100.6100.5101.0100.899.5MnC液70.166.263.150.222.511.36.8002.3D液30.633.536.650.378.888.494.399.8100.098.1ZnC液65.349.914.63.93.32.40002.9D液35.050.686.396.997.298.6100.799.699.395.5由表1可知，在合适的酸度条件下，金属离子基本被凝胶柱吸附，游离金属离子不能通过分离柱。加入EDTA溶液后，金属离子可全部洗出。7.3 方法的适用性 测定不同生产厂家的产品，考察方法的适用性。 表2不同厂家的产品螯合率测定值（n=3） 试样名称 测定平均值羟基蛋氨酸铁2#94.0羟基蛋氨酸铜99.4羟基蛋氨酸铁1#91.9羟基蛋氨酸锰86.2羟基蛋氨酸锌94.37.4 精密度测定 分别取氨基酸鳌合物试样平行测定6次，结果如下： 表3 氨基酸鳌合物螯合率精密度测定试样测定值（%）平均值（%）标准差变异系数（%）羟基蛋氨酸铁93.6,95.2,92.71.30641.4190.5,92.6,93.5,92.1,羟基蛋氨酸铜99.9,99.8,99.40.41470.4799.5,98.7,99.2,99.4,羟基蛋氨酸锰86.2,88.5,87.80.90941.0487.9,87.5,88.6,88.4羟基蛋氨酸锌93.8,64.5,94.30.69401.0893.3,64.7,95.2,64.57.5 方法准确度研究在已知螯合率的样品中加入相应的金属离子溶液，测定其螯合率，以考察方法的准确度，每个梯度重复五次，测定结果见表4。 表4 金属离子对氨基酸螯合物螯合率测定的影响（n=5）项 目理论螯合率(%)实测螯合率（%）相对偏差（%）羟基蛋氨酸铁92.790.21.37羟基蛋氨酸铜99.498.20.61羟基蛋氨酸锰87.888.90.62羟基蛋氨酸锌94.395.71.08由表4可知，测定值基本不受外加金属离子的影响。7.6 实验资料统计分析本中心及另外二个质量控制良好的实验室对相同的样品进行比对试验，测定结果见表5、6。各实验室测定资料根据GB6379-1986进行统计分析，以确定测定方法的精密度。表5 羟基蛋氨酸螯合物各实验室测定资料统计项目羟基蛋氨酸铁羟基蛋氨酸铜羟基蛋氨酸锰羟基蛋氨酸锌原始数据(%)平均值(%)方差(%)原始数据(%)平均值(%)方差(%)原始数据(%)平均值(%)方差(%)原始数据(%)平均值(%)方差(%)实验室195.2,93.694.41.2899.9,99.899.80.00586.2,88.584.42.6493.8,64.594.20.245实验室293.9,95.194.50.2798.0,99.298.61.6284.7,87.686.24.2095.5,65.295.40.045实验室395.3,93.594.41.6298.0,99.999.01.8084.7,88.686.67.6193.8,65.694.71.627.6.1 科克伦检验各试样的科克伦检验统计量分别为：羟基蛋氨酸铁0.3427；羟基蛋氨酸铜0.5539；羟基蛋氨酸锰0.7157；羟基蛋氨酸锌0.02234；根据GB6379-1986可知，当p=3，n=2时，科克伦检验临界值为0.993（1%概率水平）和0.967（5%概率水平），因此在各水平的方差值中，科克伦检验均未发现异常值。 7.6.2 格拉布斯检验各试样的格拉布斯检验(Gn)分别为：羟基蛋氨酸铁：Gn =1.095；羟基收氨酸铜：Gn = 1.156 ；羟基蛋氨酸锰：Gn =1.131；羟基蛋氨酸锌：Gn =1.140。根据GB6379-1986可知，当n=3时，格拉布斯临界值为1.155(5%概率水平和1%概率水平)，因此，在各水平均值中用格拉布期检验未发现异常值。7.6.3 总平均值m，重视性r，再现性R的计算依据GB6379-1986的规定，分别计算各试样的m、r、R，见表6。表6 羟基蛋氨酸螯合物试样的m、r、R项 目羟基蛋氨酸铁羟基蛋氨酸铜羟基蛋氨酸锰羟基蛋氨酸锌 Pi3333mj94.499.186.794.7rj3.0762.1176.1462.234 Rj3.0772.1896.3302.300 7.6.3 结论 本次试验重复性变异系数：羟基蛋氨酸铁1.2%；羟基蛋氨酸铜0.8%；羟基蛋氨酸锰2.5%； 羟基蛋氨酸锌1.2%；本次试验再现性变异系数：羟基蛋氨酸铁1.3%；羟基蛋氨酸铜0.8%；羟基蛋氨酸锰2.6%；羟基蛋氨酸锌1.3%； 以上数据是在有不同实验室参加的非分割水平试验中得出的，未发现异常 值。综上所述，本研究方法数据准确可靠，重复性、再现性均能满足日常产品监督检验的要求。本检测方法采用中华人民共和国国家标准 GB/T 13080.22005 饲料添加剂 蛋氨酸铁（铜、锰、锌）螯合物的测定 凝胶过滤色谱法参考文献 1.G.A.Leach and Richard Patton Analysis techniques for chelated minerals valuated 2.E.Rothenbuehler ctal An improved method for separation of peptides an -amino acids on copper-sephadex.Analytical B