《荧光分析法》PPT课件.ppt

1 第十一章荧光分析法 Fluorometry 2 第十一章荧光分析法 荧光 萤光 是指一种光致发光的冷光现象 当某种物质经某种波长的入射光 紫外orX射线 照射 就会发光 停止光照后 有些物质甚至仍能看到发光 持续时间长达几个小时至十几小时 1575年 西班牙医生N Monardes发现 1852年 SirGeorgeStokes对荧光产生的机理作了解释 并提出了 荧光 1867年 首次用于分析测定 1928年 Jette和West提出第一台光电荧光计 1952年 商品荧光分光光度计出现 3 第十一章荧光分析法 荧光分析法 是根据物质的荧光谱线位置及强度进行物质鉴定和含量测定的方法 优点 灵敏度高 比紫外 可见吸收高2 4个数量级 选择性好 既可依据特征发射光谱 又可根据特征吸收光谱 检测限10 10g mL 甚至10 12g mL 缺点 试样量少 应用范围较窄 4 第十一章荧光分析法 5 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 第一节荧光分析法的基本原理 一 分子荧光 一 荧光的产生 1 分子的能级与跃迁 物质分子体系中存在着电子能级 振动能级和转动能级 室温时 多数分子处在电子基态最低振动能级 S0 当受到一定辐射能的作用时 就会发生能级之间的跃迁 基态 S0 激发态 S1 S2 激发态振动能级 吸收特定频率的辐射 量子化 跃迁一次到位 激发态 基态 多种途径和方式 见能级图 速度最快 激发态寿命最短的途径占优势 吸收 发射 6 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 一 荧光的产生 2 电子激发态的多重性 第一 第二 电子激发单重态S1 S2 第一 第二 电子激发三重态T1 T2 大多数有机分子的基态处于单重态 7 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 一 荧光的产生 3 荧光的产生 电子处于激发态是不稳定状态 返回基态时 通过辐射跃迁 发光 和无辐射跃迁等方式失去能量 能量传递途径 振动弛豫 非辐射跃迁 辐射跃迁 延迟荧光 磷光 荧光 外转移 内转移 系间跨越 激发态停留时间短 返回速度快的途径 发生的几率大 发光强度相对大荧光 10 7 10 9s 第一激发单重态的最低振动能级 基态 磷光 10 4 10s 第一激发三重态的最低振动能级 基态 9 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 一 荧光的产生 3 荧光的产生 辐射能量传递过程 荧光发射 电子由第一激发单重态的最低振动能级 基态 S1 S0跃迁 发射波长为 2的荧光 10 7 10 9s由图可见 发射荧光的能量比分子吸收的能量小 波长长 2 2 1磷光发射 电子由第一激发三重态的最低振动能级 基态 T1 S0跃迁 电子由S0进入T1的可能过程 S0 T1 禁阻跃迁 S0 激发 振动弛豫 内转移 系间跨越 振动弛豫 T1 发光速度很慢 10 4 100s 光照停止后 可持续一段时间 10 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 一 荧光的产生 3 荧光的产生 非辐射能量传递过程 振动弛豫 同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁 发生振动弛豫的时间10 12s 内转换 当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时 受激分子由高电子能级以非辐射方式转移至低电子能级的过程 外转换 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁 外转换使荧光或磷光减弱或 猝灭 系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程 11 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光的激发光谱和发射光谱 荧光物质分子具有两个特征光谱 1 激发光谱 2 发射光谱 荧光光谱 固定测量波长 选最大发射波长 化合物发射的荧光强度与激发波长的关系曲线 固定激发波长 选最大激发波长 化合物发射的荧光与发射波长的关系曲线 绘制方法 固定发射单色器在某一波长 以不同波长的入射光激发荧光物质 记录荧光强度 F 对 ex 的关系曲线 激发光谱 绘制方法 固定激发光的波长和强度 检测各种波长下对应的荧光强度 记录荧光强度 F 对 em 的关系曲线 荧光光谱 12 蒽的激发光谱 吸收光谱 和发射光谱 荧光光谱 激发光谱ExcitationSpectrum 激发波长 ex 发射光谱EmissionSpectrum 发射波长 em 13 荧光分析法测定血清中的镁 镁 Oxine的激发光谱和发射光谱 Oxine 8 羟基喹啉 14 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光的激发光谱和发射光谱 3 激发光谱与发射光谱的关系 a 斯托克位移 Stokesshift 是荧光发射波长总是大于激发光波长的现象 激发态分子通过内转换和振动弛豫过程迅速达到S1 的最低振动能级 消耗了能量 b 发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级 吸收不同波长的能量 如能级图 2 1 产生不同吸收带 但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 产生波长一定的荧光 如 2 c 镜像规则通常荧光发射光谱与它的激发光谱 与吸收光谱形状一样 成镜像对称关系 15 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光的激发光谱和发射光谱 镜像规则的解释 激发光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的 其形状决定于第一电子激发态中各振动能级的分布情况 荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能层回到基态中各不同能层形成的 所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能级的分布情况 16 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光的激发光谱和发射光谱 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大 相反跃迁也是 17 S0 S1 V 0 V 1 V 2 V 0 V 1 V 2 b0 b1 b2 c2 c1 c0 E2 E1 E2 E1 b0 c0 b1 b2 c1 c2 镜像关系解释示意 200 250 300 350 400 450 500 荧光激发光谱 荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱幻灯片31 19 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光与分子结构 分子产生荧光必须具备的条件 具有强的紫外 可见吸收 具有一定的荧光量子产率 20 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光与分子结构 一 荧光量子产率荧光效率 荧光量子产率又称荧光效率 是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比 常用 f表示 一般物质的 f在0 1之间 荧光量子产率与物质吸收的能量以何种形式释放有关 若能量都以无辐射跃迁形式释放 外转换过程速度快 则不出现荧光发射 21 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光与分子结构 二 有机化合物分子结构与荧光的关系 1 共轭效应 跃迁芳香族化合物 五元杂环上取代苯基共轭程度越大 荧光效率越大 波长长移 22 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 荧光与分子结构 二 有机化合物分子结构与荧光的关系 1 共轭效应 跃 苯萘蒽 ex205nm286nm356nm em278nm321nm404nm f0 110 290 36 维生素A ex 327nm em 510nm 23 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 有机化合物分子结构与荧光的关系 2 刚性结构和共平面效应 酚酞 无荧光 荧光黄 联二苯 0 2 芴 1 0 24 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 有机化合物分子结构与荧光的关系 2 刚性结构和共平面效应 8 羟基喹啉 弱荧光 红色荧光 3 4 苯并芘 强荧光物质 25 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 有机化合物分子结构与荧光的关系 3 取代基的作用 给电子基增强荧光 增加分子 电子的共轭程度 OH OR NH2 NHR NR2 C N吸电子基减弱荧光 减弱分子中 电子的共轭程度 COOH C O NO2 N N Cl Br I与 体系作用小的取代基影响不明显 SO3R NH3 SH F R 26 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 二 有机化合物分子结构与荧光的关系 取代基之间若发生氢键 增强分子平面性和刚性会加强荧光 3 取代基的作用 27 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 三 影响荧光强度的外部因素 1 温度的影响荧光强度对温度变化敏感 温度增加 外转换去活的几率增加 2 溶剂的影响除一般溶剂效应外 溶剂的极性 黏度 氢键 配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化 3 溶液pH对酸碱化合物 溶液pH的影响较大 需要严格控制 28 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 三 影响荧光强度的外部因素 4 荧光熄灭剂 荧光熄灭又称荧光淬灭 是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂 如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后 荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系 则可利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量 该方法称为荧光熄灭法 29 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 三 影响荧光强度的外部因素 5 散色光 当一束平行单色光照射在液体样品上时 大部分光线透过溶液 小部分由于光子和物质分子相碰撞 使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射 该光称为散射光 瑞利散射光子与物质发生弹性碰撞 不发生能量交换 仅是光子运动方向发生变化 拉曼散射光子与物质发生非弹性碰撞 发生能量交换 光子运动方向改变 其波长与荧光波长接近 对荧光测定干扰更大 消除方法 选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰 图11 6 30 第十一章荧光分析法 第一节荧光分析法的基本原理 三 影响荧光强度的外部因素 5 散色光 a 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光b 0 1mol L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光 选择320nm做激发波长 31 第十一章荧光分析法 32 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 第二节荧光定量分析方法 荧光F 由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光 So 溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收的程度以及荧光效率有关 33 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 第二节荧光定量分析方法 一 荧光强度与物质浓度的关系 定量依据荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度 F I0 It F K I0 It K 常数 取决于荧光效率 11 2 根据朗伯 比尔定律 It I010 Ecl 11 3 将 11 3 代入 11 2 F K I0 1 10 Ecl K I0 1 e 2 3Ecl 若c很小 当Ecl 0 05时 F 2 3K I0Ecl Kc 11 6 So 在低浓度时 溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度成线性关系 F Kc 34 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 第二节荧光定量分析方法 一 荧光强度与物质浓度的关系 F 2 3K I0Ecl Kc 荧光 A lg I0 It kc 朗伯比尔定律 为什么荧光分析法的灵敏度比紫外 可见分光光度法的灵敏度高 FL 测定的是很弱的背景上的荧光强度 I0 其测定灵敏度取决于检测器的灵敏度 只要改进光电倍增管和放大系统 极微弱的荧光也能检测到 可以测浓度很小的溶液 UV Vis 测定的是I0 It 当浓度很低时 检测器难以检测两个放大信号之间的微小差别 即比值仍然保持不变 对提高检测灵敏度不起作用 35 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 第二节荧光定量分析方法 一 荧光强度与物质浓度的关系 高浓度时 荧光物质发生自熄灭和自吸收现象 使F与c不呈线性关系 一般当 bc 0 05时 F与c呈线性关系幻灯片18 36 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 二 定量分析方法 1 标准曲线法 校正曲线法 a 确定 ex和 em 激发光谱和发射光谱 b 确定适宜的条件 试剂浓度 pH T t等 c 以标准溶液做工作曲线 d 测未知样的荧光强度 F 根据工作曲线计算荧光物质的浓度 37 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 二 定量分析方法 2 比例法 在线性范围内 测定标样和试样的荧光强度 比较 例 中国药典 采用荧光法测定利血平片的含量 3 联立方程式法 此法用于多组分混合物的荧光分析 类似于紫外 可见吸收分光光度法 不经分离就可测得混合物中被测组分 38 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 三 荧光分析法的特点和应用 灵敏度高 测定下限0 1 0 001 g mL 比分光光度法高2 4个数量级 在黑背景下检测 光源的强度大 选择性高 适当选择激发光的波长和荧光测定的波长 应用荧光寿命的差别 时间分辨技术 荧光寿命 是当除去激发光源后 分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1 e所需时间 39 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 三 荧光分析法的特点和应用 荧光测定的选择性 蒽的激发和发射光谱 菲和蒽的荧光光谱 激发波长265nm 菲在360nm以上无吸收 用365nm激发光时 菲无荧光 可以在400nm测定蒽的荧光 在265nm 蒽和菲均有吸收 以此波长的光激发 在350nm只有菲有荧光 故可测定菲 40 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 MFS与UV Vis法比较 原理UV Vis吸收MFS发射 41 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 荧光光度法的应用 生物化学分析 生理医学研究 临床检测 直接测定能产生荧光的物质 带苯环的氨基酸 色氨酸 酪氨酸 苯基丙氨酸 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质 荧光生色团标记蛋白质 研究蛋白质的结构 致癌物同核酸结合常引起显著的荧光 无机离子 Mg2 Al3 Zn2 Be 等 可同试剂形成荧光络合物 荧光熄灭法测定猝灭剂Ni2 对Al PAN络合物有荧光猝灭作用 可测Ni2 6 10 5 6 10 3 g mL 1 42 N OH 8 羟基喹啉 Al Be等 茜素紫酱R Al F 等 用于测定无机离子的有机试剂 黄酮醇 Zr Sn等 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 荧光光度法的应用 43 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 荧光光度法的应用 无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量 可测量约60多种元素 铍 铝 硼 镓 硒 镁 稀土常采用荧光分析法 氟 硫 铁 银 钴 镍采用荧光熄灭法测定 铜 铍 铁 钴 锇及过氧化氢采用催化荧光法测定 铬 铌 铀 碲采用低温荧光法测定 铈 铕 锑 钒 铀采用固体荧光法测定 44 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 荧光光度法的应用 无机化合物的分析 45 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 荧光光度法的应用 生物与有机化合物的分析 46 第十一章荧光分析法 第二节荧光定量分析方法 荧光光度法的应用 举例 痕量3 4 苯并芘的测定 萃取 环己酮或石油醚 浓缩 层析 以H2SO4溶解苯并芘 荧光分析 荧光测定 ex 520nm em 545nm 47 第十一章荧光分析法 48 第十一章荧光分析法 第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术 第三节荧光分光光度计和其他荧光分光技术 一 荧光分光光度计 49 第十一章荧光分析法 第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术 一 荧光分光光度计 测量荧光的仪器主要由四个部分组成 激发光源 样品池 双单色器系统 检测器 激发光源 能够在紫外 可见光区连续发光 常用氙灯 高压汞灯或激光光源 样品池 石英池 四壁透明 单色器 两个光栅单色器 分置于样品池前后 检测器 光电池或光电倍增管 与激发光成直角的方向检测荧光 50 第十一章荧光分析法 第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术 一 荧光分光光度计 仪器光路图 激发单色器 发射单色器 氙灯 样品池 光电倍增管 51 第十一章荧光分析法 第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术 一 荧光分光光度计 荧光仪的校正 1 灵敏度校正 每次测定时 在选定波长及狭缝宽度的条件下 先用一种稳定的荧光物质 配成浓度一致的对照品溶液对仪器进行校正 即每次将荧光强度调节到相同数值 2 波长校正 若光学系统或检测器有变的 或较长时间使用之后 应对单色器波长刻度重新校正 3 激发光谱和荧光光谱的校正 产生误差的主要原因 光源的强度随波长的变化及每个检测器对不同波长光的接受程度不同 及检测器的感应与波长不呈线性 52 第十一章荧光分析法 第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术 二 其他荧光分析技术简介 近十几年来 在其它学科迅速发展的影响下 随着激光 微处理机和电子学的新成就等一些新的科学技术的引入 大大推动了荧光分析法在理论方面的进展 促进了诸如同步荧光测定 导数荧光测定 时间分辨荧光测定 相分辨荧光测定 荧光偏振测定 荧光免疫测定 低温荧光测定 荧光显微镜 荧光显微镜荧光显微镜 固体表面荧光测定 荧光反应速率法 三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法 新技术的发展 并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世 使荧光分析法不断朝着高效 痕量 微观和自动化的方向发展 方法的灵敏度 准确度和选择性日益提高 方法的应用范围大大扩展 遍及于工业 农业 医药卫生 环境保护 公安情报和科学研究等各个领域中 53 第十一章荧光分析法 第三