动物生物化学第二章课件结构与功能.pptVIP

第二章蛋白质的结构与功能 目的要求了解氨基酸的分类 结构和一些重要的化学性质 掌握肽键 蛋白质一级结构概念 掌握 螺旋 折叠的结构特征 二级 三级和四级结构概念 掌握蛋白质的性质及变性机理 第一节 蛋白质在生命活动中的重要作用 酶的催化功能 控制生长和分化 运输和贮存功能 运动功能 结构支持作用 免疫保护作用 接受和传递信息8 调节代谢 感染和毒性作用 其它作用 第二节蛋白质的化学组成 一 蛋白质的元素组成蛋白质一般含有 碳50 55 氢6 8 氧20 23 氮15 17 硫0 3 2 5 在某些蛋白质中 还含有微量的磷 铁 铜 钼 碘 锌等元素 各种蛋白质的氮含量比较恒定 平均值为16 左右 这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据 蛋白质含量 蛋白质含N量 6 25 二 氨基酸 一 氨基酸的结构和构型蛋白质中常见的氨基酸有20种 除脯氨酸以外 这些天然氨基酸在结构上的共同点是 与羧基 COOH 相邻的 碳原子 C 上都有一个氨基 NH2 因而称为 氨基酸 脯氨酸的结构式 氨基酸的构型 除甘氨酸 图1 以外 其余19种氨基酸的C 都是不对称 手性 碳原子 因此所有天然氨基酸都具有旋光性 每一种氨基酸都有D 型和L 型两种构型 天然蛋白质中的所有氨基酸都是L 型氨基酸 氨基酸D 型和L 型构型结构式 二 氨基酸的分类 根据R侧链极性和电荷的不同 可以将常见氨基酸分成四类 二十种常见蛋白质氨基酸的分类 结构及三字符号 据R基团化学结构分类 脂肪族 A 中性 含羟基或巯基 酸性 碱性 图 芳香族 A Phe Tyr Trp 图 杂环 His Pro 图 据R基团极性分类 极性R基团AA 非极性R基团AA 种 不带电荷 种 带电荷 正电荷 种 负电荷 种 据氨基 羧基数分类 一氨基一羧基 一氨基二羧基 Glu Asp 二氨基一羧基 Lys His Arg 人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThrArg His 甘氨酸 Gly 丙氨酸 Ala 缬氨酸 Val 亮氨酸 Lue 异亮氨酸 Ile 中性脂肪族氨基酸 含羟基或硫脂肪族氨基酸 丝氨酸 Ser 苏氨酸 Thr 半胱氨酸 Cys 甲硫氨酸 Met 返回 杂环氨基酸 组氨酸 His 脯氨酸 Pro 返回 芳香族氨基酸 苯丙氨酸 Phe 酪氨酸 Tyr 色氨酸 Trp 返回 非极性R基团氨基酸 不带电荷极性R基团氨基酸 带电荷R基团氨基酸 酸性氨基酸及酰胺 天冬氨酸 Asp 谷氨酸 Glu 天冬酰胺 Asn 谷氨酰胺 Gln 碱性氨基酸 赖氨酸 Lys 精氨酸 Arg 特殊氨基酸 脯氨酸半胱氨酸 三 稀有氨基酸 除了上述20种广泛存在于各种蛋白质之中的常见氨基酸以外 还有一些仅存在于少数蛋白质中的稀有L 型氨基酸 这些氨基酸是常见氨基酸的衍生物 是经过化学修饰的氨基酸 它们没有遗传密码 是在蛋白质生物合成以后 通过有关酶的催化修饰而形成的 四 非蛋白质氨基酸 有一些氨基酸不参与蛋白质的组成 而是以游离的状态存在于生物体之中 四 氨基酸的主要的理化性质 一 氨基酸的光吸收特性 二 氨基酸的两性解离及等电点 三 氨基酸的化学反应 一 氨基酸的光吸收特性 参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见光区都没有光吸收 在紫外光区只有色氨酸 酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力 其最大吸收波长 分别为279 278 259nm 光吸收的利用 二 氨基酸的两性解离及等电点 氨基酸分子既含有酸性的羧基 COOH 又含有碱性的氨基 NH2 其中的 COOH能放出质子 H 而变成 COO 其中的 NH2能接受质子 而变成 NH3 因此 氨基酸是两性电解质 ampho1yte 氨基酸两性解离示意图 氨基酸的两性解离性质及等电点 pH pI净电荷 0 pH pI净电荷为正 pH pI净电荷为负 pK 1 pK 2 当氨基酸溶液在某一定pH值时 使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等 成为两性离子 在电场中既不向阳极也不向阴极移动 此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点 isoelectricpoint pI 例题 1 精氨酸的pK1 COOH 2 17 Pk2 NH3 9 04 Pk3 胍基 12 08 则其PI值是多少 2 1 当Ala Ser Phe Leu Arg Asp和His的混合物在pH3 9进行纸电泳时 哪些氨基酸移向正极 哪些氨基酸移向负极 2 设Ala Val Glu Lys和Thr的混合物pH为6 0 试指出纸电泳后氨基酸的分离情况 氨基酸等电点的计算 可见 氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK 值之和的二分之一 氨基酸的等电点的作用 在一定的实验条件下 等电点是氨基酸的特征常数 不同的氨基酸 由于R基结构的不同 而有不同的等电点 当氨基酸处于等电点状态时 由于静电引力的作用 其溶解度最小 容易发生沉淀 利用这一特性可以从各种氨基酸的混合物溶液中分离制取某种氨基酸 三 氨基酸的化学反应 1 氨基的化学反应 2 羧基的化学反应 3 R 基的化学反应 茚三酮反应示意图 第三节蛋白质分子的结构 一 蛋白质结构的层次构型 当一个碳原子共价结合四个不同的基团或原子时 可以形成不对称的立体结构 产生旋光现象 构象 指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态 构象形态间的改变不涉及共价键的破裂 每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或三维结构 称之为蛋白质的构象 一个给定的蛋白质可以有多种构象 但只有一种或少数几种在能量上是有利的 蛋白质的结构 一级结构 即共价结构 指多肽链的氨基酸序列 二级结构 指多肽链借助氢键形成 螺旋和 折叠片 三级结构 指多肽链借助各种非共价键弯曲 折叠成具有特定走向的紧密球状结构 四级结构 指多聚蛋白质的各亚基之间在空间上的相互缔合关系 蛋白质的一级结构 primarystructure 是指 多肽链上各种氨基酸残基的排列顺序 即氨基酸序列 二 蛋白质的一级结构 三 肽键和肽链 肽键一个氨基酸分子的 羧基与另一个氨基酸分子的 氨基缩合 失去一个水分子 从而酰氨键 肽键 是连接多肽链中氨基酸残基的唯一共价键 三 肽键和肽链 肽 peptide 由氨基酸分子缩合而成的化合物 称为肽 其中 由两个氨基酸形成的化合物称为二肽 包含一个肽键 peptidebone 三个 四个等氨基酸形成的称为三肽 四肽等 三个以上的肽又统称为多肽 polypeptide 由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的链状多肽 称为多肽链 polypeptidechain 氨基酸残基 多肽链上的每个氨基酸 由于形成肽键而失去了一分子水 成为不完整的分子形式 这种不完整的氨基酸被称为氨基酸残基 aminoacidresidue 肽单位 肽键又称酰胺键 肽键上的所有原子以及与之相连的 碳原子 C 均处在同一平面内 称为酰胺平面 蛋白质主链骨架可以看成是由多个酰胺平面通过 碳原子 C 连接而成的长链 酰胺平面又称肽单位 蛋白质的一级结构的命名 蛋白质的一级结构 通常根据参与组成多肽链的氨基酸残基种类 按照其排列顺序 从N 末端氨基酸残基开始 依次命名为某氨基酰某氨基酰 氨基酸 甲硫脑啡肽命名举例中文氨基酸残基命名法 酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甲硫氨酸中文单字表示法 酪 甘 甘 苯丙 甲硫12345三字母符号表示法 Tyr G1y G1y Phe Met 谷胱甘肽 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程 作为某些氧化还原酶的辅因子 或保护巯基酶 或防止过氧化物积累 蛋白质一级结构的测定 测定多肽链的数目 蛋白质测序的步骤 拆分多肽链 断开多肽链内的二硫键 测定每一肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的N 末端和C 末端 裂解多肽链为较小的肽段 测定各肽段的氨基酸序列 利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构 确定二硫键的位置 蛋白质顺序测定基本战略 蛋白质测序的重要方法 N 末端测定 二硝基氟苯 DNFB 法 肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP 肽 最后水解生成黄色DNP 氨基酸 丹磺酰氯 DNS 法 用DNS取代DNFB 生成DNS 氨基酸 苯异硫氰酸 PITC 法 生成PTH 氨基酸 从肽上断裂下来 氨肽酶法 外切酶 但效果不好 C 末端测定 肼解法 测定C 末端的最重要的化学方法 肽与肼反应 除C 末端氨基酸游离外 其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物 还原法 C 末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的 氨基醇 羧肽酶法 最有效 最常用 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶C 羧肽酶Y 二硫键的断裂 过甲酸氧化法 将二硫键氧化成磺酸基 巯基化合物还原法 将二硫键还原成巯基 然后用烷基化试剂如碘乙酸保护巯基 防止其重新被氧化 氨基酸组成的测定 酸水解 是主要方法 多用HCl 同时辅以碱水解 所得氨基酸不消旋 但Trp全部被破坏 Ser Thr Tyr部分破坏 Asn和Gln的酰氨基被水解 生成Asp和Glu 多肽链的裂解 酶裂解 胰蛋白酶 专一性强 断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键 糜蛋白酶 断裂Phe Trp Tyr Leu等疏水氨基酸的羧基端肽键 嗜热菌蛋白酶 专一性差 断裂Val Leu Phe Tyr Trp等氨基参与形成的肽键 胃蛋白酶 在酸性条件稳定 肽键两侧均为疏水氨基酸 在确定二硫键位置时 常用到此酶 其它酶 略 化学裂解 溴化氰 CNBr 只断裂Met的羧基形成的肽键 羟氨 NH2OH 在pH9时 专一性断裂Asn Gly之间的肽键 其它条件下不专一 例题 有一七肽 氨基酸组成为 Lys Pro Arg Phe Ala Tyr Ser 不经酶解时与FDNB不反应 糜蛋白酶水解得二肽段 其氨基酸组成分别是 Ala Tyr Ser和Pro Phe Lys Arg 与FDNB反应得DNP Ser和DNP Lys 胰蛋白酶水解得二肽段 氨基酸组成为 Arg Pro和Phe Tyr Lys Ser Ala 求次肽一级结构 第四节蛋白质的高级结构 一 蛋白质的结构层次二 肽单位平面结构和二面角三 维持蛋白质分子构象的化学键四 二级结构五 超二级结构六 结构域七 三级结构八 四级结构 一 蛋白质的结构层次 蛋白质分子的结构 有不同的结构层次 一级结构 primarystructure 二级结构 secondarystructure 超二级结构 supersecondarystructure 结构域 structuraldomain 三级结构 tertiarystructure 四级结构 quarternarystructure 蛋白质结构的主要层次 一级结构 四级结构 二级结构 三级结构 primarystructure secondarystructure Tertiarystructure quariernarystructure 二 肽单位平面结构和二面角 一 肽单位的特征 1 肽键的键长是0 1325nm 比C N单键 键长0 147nm 短些 比C N双键 键长0 127nm 长些 因此 肽键具有部分双键的性质 不能自由旋转 2 肽单位是刚性平面结构 这就是说 肽单位上的6个原子都位于同一个刚性平面上 称为酰胺平面 图 3 在肽单位上 C O与N H或者C 一C与C 一N 虽然可以有顺式和反式两种排布 但是 实际上除含有Pro的肽单位以外 多肽链上绝大多数肽单位 其C O和N H都是反式排布的 这是因为反式构型的能量比顺式构型的能量低的缘故 肽单位平面结构有一定的键长 键角 二 二面角 C 2原子位于相邻二个肽平面的交线上 C 2原子上的C 2 N1和C 2 C2键都是单键 肽平面1可以围绕C 2 N1单键旋转 其旋转的角度用 表示 肽平面2也可以围绕C 2 C2单键旋转 其旋转的角度用 表示 由于 和 这二个转角决定了相邻二个肽平面在空间上的相对位置 因此 习惯上将这二个转角称为二面角 dihedralangle 二面角决定多肽链主链骨架的构象 酰胺平面与 碳原子的二面角 和 二面角两相邻酰胺平面之间 能以共同的C 为定点而旋转 绕C N键旋转的角度称 角 绕C C 键旋转的角度称 角 和 称作二面角 亦称构象角 二面角决定多肽链主链骨架的构象 三 维持蛋白质的三维结构的化学键 研究蛋白质构象的方法 至今研究蛋白质三维结构的成就主要是应用间接的X 射线衍射法 研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法 了解 稳定蛋白质三维结构的作用力 非共价键 次级键 氢键 范德华力 疏水作用 突出地位 离子键 盐键 静电引力 共价键 二硫键 重要作用 维持蛋白质分子构象的作用力a 盐键b 氢键c 疏水键d 范德华力e 二硫键 多肽链 四 蛋白质的二级结构 螺旋 helix 折叠 pleatedsheet 转角 turn 无规则卷曲 nonregularcoil 蛋白质的二级结构 secondarystructure 指蛋白质分子中某一段肽链借助氢键形成的局部空间结构 也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置 并不涉及氨基酸残基侧链的构象 主要有以下类型 蛋白质分子中多个肽单位通过氨基酸 碳原子的旋转 使多肽链主链围绕一个中心轴呈有规律的螺旋上升 形成的稳定螺旋构象1 每隔3 6个AA残基螺旋上升一圈 螺距0 54nm2 螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧 链中的全部 C 0和 N H几乎都平行于螺旋轴3 每个氨基酸残基的 N H与前面第四个氨基酸残基的 C 0形成氢键 肽链上所有的肽键都参与氢键的形成 一 螺旋 helix 代表蛋白质 角蛋白 四 蛋白质的二级结构 形成因素 与 组成和排列顺序直接相关特例多态性 多数为右手 较稳定 亦有少数左手螺旋存在 不稳定 存在尺寸不同的螺旋 二 折叠片 特征 相邻的两条或多条伸展的多肽链 或一条多肽链的若干肽段 侧向集聚 通过相邻肽链主链上的N H与C O之间有规则的氢键 形成锯齿状片层结构 即 折叠片 类别 平行反平行 代表蛋白质 丝心蛋白 三 转角 turn 特征 多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基 n 3 的氮原上的氢之间形成氢键 肽键回折1800 无规则卷曲示意图 无规则卷曲 细胞色素C的三级结构 五 蛋白质的超二级结构和结构域 2 结构域 structuredomain 在球状蛋白质分子中相邻的二级结构单位 即单个 螺旋或 折叠或 转角 组合在一起 相互作用形成有规则的 在空间上能辩认的二级结构集合体 充当更高层次结构的构件 称为蛋白质的超二级结构基本组合方式 较大的球蛋白分子 一条多肽链在二级结构的基础上 进一步卷曲折叠成几个相对独立 近似球形的区域 彼此分开 以松散的单条肽链相连 这种相对独立的区域称为结构域 它是大球蛋白分子三级结构的折叠单位 形成意义 动力学上更为合理 蛋白质 酶 活性部位往往位于结构域之间 使其更具柔性 超二级结构 supersecondarystructure 超二级结构类型 12345 52341 链 迂回 回形拓扑结构 回形拓扑结构 迂回 卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域 螺旋 转角 折叠 二硫键 结构域1 结构域2 平行 折叠的结构比较 a 园桶形排布 b 马蹄形排布 六 三级结构 指一条多肽链在二级结构 超二级结构及结构域 的基础上 进一步的盘绕 折叠 从而产生特定的空间结构或者说三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布 维系三级结构的力有疏水作用力 氢键 范德华力 盐键 静电引力 另外二硫键在某些蛋白质中也起着非常重要的作用 七 四级结构 亚基 蛋白质四级结构中 每一条多肽链都具有球状三级结构 称为亚基 一般只包含一条多肽链 也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成亚基缔合 亚基缔合的驱动力主要是疏水相互作用 亚基缔合的专一性由相互作用的表面上的极性基团之间的氢键和离子键决定四级结构 指由相同或不同的亚基 subunit 按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构 包括亚基的种类 数目 空间排布及相互作用 血红蛋白四级结构 第五节多肽 蛋白质的结构与功能的关系 一 一级结构与功能的关系二 同功能蛋白质结构的种属差异与保守性三 蛋白质变构与功能的关系四 蛋白质构象转变与功能的关系五 蛋白质修饰与功能的关系 一 一级结构与功能的关系 一级结构和功能呈严格对应关系1 牛胰岛素2 分子病 因基因突变使蛋白质一级结构氨基酸改变 造成蛋白质生物功能改变而产生的疾病 3 催产素和加压素在人和高等动物体内 有不少游离的多肽 如 催产素 加压素 生长激素 脑啡肽等 它们分别具有不同的激素功能 对体内新陈代谢起调节作用 催产素 oxytocin 和加压素 vasopression 都是由人和高等动物的垂体后叶所分泌的多肽激素 催产素能促进子宫和乳腺平滑肌收缩 临床上用于引产和减少产后出血 加压素有增加血压和抗利尿的作用 临床上用于治疗尿崩症等 牛催产素S SCys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly NH2123456789牛加压素S SCys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Leu Gly NH2 二 同功能蛋白质结构的种属差异与保守性 1 不同生物来源的胰岛素一级结构比较比较各种哺乳类 鸟类和鱼类等动物的胰岛素 insulin 一级结构 发现组成胰岛素分子的51个氨基酸残基中 只有24个氨基酸残基始终保持不变 为不同生物所共有 这些始终不变的氨基酸残基 称为保守氨基酸残基 保守残基 一般认为 激素的活性中心以及维持活性中心构象的氨基酸残基不能改变 否则 激素将失去生物活性 蛋白质的氨基酸序列与生物功能 肽合成 同源蛋白质 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质 同源蛋白质具有共同的进化起源 同源蛋白质具有明显的氨基酸序列相似性 称之为序列同源 根据同源蛋白质的氨基酸序列资料可建立系统树 进化树 两个物种的同源蛋白质 其序列中氨基酸的差异数目与这些物种间的进化发生差异是成比例的 蛋白质激活 在生物体内有些蛋白质是以前体形式合成 不具有活性 只有按一定方式裂解除去部分肽链后才具有生物活性 称之为蛋白质激活 如酶原激活 肽的人工合成 氨基酸共聚合 由一种或两种氨基酸反应 控制合成 由不同氨基酸按一定顺序 接肽反应需接肽试剂 为避免接肽试剂与某些活泼基团反应 故在接肽前须首先将这些基团加以封闭或保护 如氨基保护或羧基保护等 在正常条件下 羧基和氨基之间不会自发形成肽键 即氨基或羧基需活化 通常是羧基活化 固相肽合成 是控制合成技术的巨大进步 利用固相肽合成仪已成功合成多种肽和蛋白质 其实质是肽的羧基端第一个氨基酸共价挂接在树脂上 然后加入氨基受保护的第二个氨基酸并发生缩合反应 形成肽键 依次类推 最后是肽与树脂断裂并去掉氨基端的保护基团 二 同功能蛋白质结构的种属差异与保守性 2 不同生物来源的细胞色素C一级结构比较对50多种不同生物来源的细胞色素C的一级结构作了比较研究 发现35个氨基酸在各种生物中是保守的 其中 有Cysl4 Cysl7 Hisl8 Met80 Tyr48和Trp59 三 蛋白质变构与功能的关系 肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质 它们是蛋白质结构与功能的范例 肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质 它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上具有明显的同源性 它们的构象和功能也十分相似 肌红蛋白 珠蛋白 含153个氨基酸残基 为1条肽链 辅基血红素 原卟啉 与Fe的络合物称血红素 卟啉化合物有很强的着色力 使生物组织呈现特定的颜色 卟啉环中心的铁原子有6个配位键 其中4个与四吡咯环的N原子相连 另2个沿垂直于卟啉环面的轴分布在环面的上下 这两个键合部位分别称为第5和第6配位 铁原子可以是亚铁 Fe2 或高铁 Fe3 相应的血红素称为亚铁血红素和高铁血红素 相应的肌红蛋白称为亚铁肌红蛋白和高铁肌红蛋白 类似的命名也用于血红蛋白 其中只有亚铁态的蛋白质才能结合O2 在肌红蛋白分子中 血红素共价地结合于肌红蛋白分子的疏水空穴中 其中血红素铁在第5配位键与珠蛋白第93位His残基的咪唑N配位结合 第6配位键处于开放状态 是O2的结合部位 当第6位被O2分子所占据时 即为氧合肌红蛋白 血红素中Fe2 能进行可逆氧合作用 血红素的铁原子如果处在水环境则容易被氧化成Fe3 失去氧合能力 此时H2O分子代替O2成为Fe3 的第6个配体 CO能与O2竞争第6配位键 且结合能力远大于O2 血红蛋白 Hb 的主要功能是在血液中结合并转运氧气 它存在于红细胞中 Hb的结构 脊椎动物的Hb由4个多肽链亚基组成 其中2个是一种亚基 2个是另一种亚基 如成人的血红蛋白主要是HbA 亚基组成为 2 2 次要组分是HbA2 亚基组成为 2 2 每个血红蛋白分子都有4个血红素 每个血红素分别位于每个多肽链中的裂隙处 并暴露在分子的表面 氧合过程中的构象变化 氧合作用显著改变Hb的四级结构 且氧合血红蛋白和去氧血红蛋白具有不同的构象 氧合曲线和别构效应 氧合曲线呈S形曲线 氧饱和度与氧分压之间 即血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应 一个O2的结合增加同一Hb分子中其余空的氧合部位对O2的亲合力 Hb对O2亲和力的影响因素 H CO2促进O2从血红蛋白中释放 O2也促进H CO2在肺泡毛细血管中释放 BPG 2 3 二磷酸甘油酸 降低Hb对O2的亲和力 其只与去氧血红蛋白结合 血红蛋白分子病 导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生分子病 这是一种遗传病 了解最清楚的分子病是镰刀状细胞贫血病 该病人的不正常的血红蛋白称HbS 它只是在两条 链的N端第6位上Glu被Val置换 这一改变使血红蛋白表面产生一个疏水小区 导致血红蛋白聚集成不溶性的纤维束 并引起红细胞镰刀状化和输氧能力降低 地中海贫血是由于缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因造成的 第六节 蛋白质的生物学性质 一 种属特异性不同种生物的蛋白质其化学成分和分子结构存在不同差异二 组织特异性同一动物体各个组织蛋白质分子结构和功能各有差异 三 蛋白质的变性与复性 蛋白质变性 当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响 使其分子内部原有的高级构象发生变化时 蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失 但并未导致其一级结构的变化 这种现象称为变性作用 denaturation 变性的表现 生物活性丧失 物理性质 溶解度 粘度 扩散系数 光谱特性等 和化学性质 化学反应 被酶解性 改变变性机理 蛋白质的空间构象是通过各种次级键来维持的 蛋白质变性的实质是分子中次级键被破坏 引起天然构象解体 变性不涉及共价键破坏 即蛋白质一级结构仍保持完好 复性 当变性因素除去后 变性蛋白质又可重新回复到天然构象 此为蛋白质的复性 是否蛋白质变性与复性可逆 仍有疑问 应用 变性灭菌 消毒 变性制食品 抗衰老 核糖核酸酶变性与复性作用 Nativeribonuclease Denativereducedribonuclease Nativeribonuclease 变性 复性 第七节 蛋白质的物理化学性质和分离纯化 蛋白质的分子量蛋白质的两性解离和等电点电泳蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀蛋白质的呈色反应蛋白质的光吸收特征 一 蛋白质的理化性质 测定蛋白质分子相对质量的方法 根据化学组成测定最低相对分子质量 测定某一微量元素或某一氨基酸的含量如铁原子或色氨酸 并假设蛋白质分子中只有一个铁原子或一个色氨酸 即最低相对分子质量 铁的原子量 铁的百分含量 渗透压法 在半透膜存在时 蛋白质溶液将产生渗透压 平衡时的静水压力 理想溶液的渗透压与溶质的浓度呈线性相关 其关系可用范托夫公式表示 cRT Mr 在高分子溶液中 c RT Mr Kc 渗透压法简单 准确 且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响 但受pH的影响 不能区别溶液中蛋白质分子是否均一 沉降法 离心力作用 沉降速率法 单位离心场的沉降速度是个定值 称沉降系数s 沉降平衡法 沉降产生浓度梯度 凝胶过滤法 标准蛋白质 已知Mr和斯托克半径 和待测蛋白质必须具有相同的分子形状 接近球体 分子形状为线型或与凝胶发生吸附的蛋白质不可用此法测定 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 加入SDS和少量巯基乙醇 则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量 而与电荷和分子形状无关 蛋白质两性解离性质和等电点 当蛋白质溶液在某一定pH值时 使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等 成为两性离子 在电场中既不向阳极也不向阴极移动 此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 isoelectricpoint pI 电泳 概念在直流电场中 带正电荷的蛋白质分子向阴极移动 带负电荷的蛋白质分子向阳极移动 这种现象 称为电泳 electrophoresis 常用电泳方法 蛋白质胶体性质 由于蛋白质分子量很大 在水溶液中形成1 100nm的颗粒 因而具有胶体溶液的特征 可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基 对水有很高的亲和性 通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层 同时这些颗粒带有电荷 使蛋白质不能互相结合 而以分子形式存在 因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体 蛋白质胶体性质的应用透析法 利用蛋白质不能透过半透膜的的性质 将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中 小分子杂质被透析出 大分子蛋白质留在袋中 以达到纯化蛋白质的目的 这种方法称为透析 dialysis 盐析法 在蛋白质溶液中加少量的中性盐会增加蛋白质表面的电荷而形成很好的水膜 从而增大蛋白质在水溶液中的溶解度 这种现象称为盐溶 saltingin 在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵 氯化钠等中性盐 可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层 同时又中和了蛋白质表面的电荷 从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀 这种现象称为盐析 saltingout 凝胶 蛋白质的沉淀 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层 消除相同电荷 除去水膜 蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀 沉淀方法类别 1 高浓度中性盐 盐析 盐溶 2 有机溶剂沉淀3 重金属盐类沉淀4 生物碱试剂和某些酸类沉淀5 加热变性沉淀 蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应酚试剂反应 蛋白质定量 定性茚三酮反应测定常用方法 蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质在远紫外光区 200 230nm 有较大的吸收 在280nm有一特征吸收峰 可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定 测定范围 0 1 0 5mg ml 二 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离和纯化主要是利用蛋白质之间各种特性的差异 包括蛋白质分子的酸碱性质 分子的大小和形状 溶解度 吸附性质和对配体分子的特异亲合力 蛋白质的酸碱性质 蛋白质是两性电解质 在蛋白质分子中 可解离基团主要来自侧链上的功能团 此外还有少数的末端 羧基和 氨基 可以把蛋白质分子看作是一个多价离子 所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离基团的种类和数目以及溶液的pH所决定的 对某一种蛋白质来说 在某一pH时 它所带的正电荷与负电荷恰好相等 即净电荷为零 这一pH称蛋白质的等电点 蛋白质的等电点在中性盐存在下可发生明显的变化 这是由于蛋白质分子中的可解离基团可与中性盐中的阳离子或阴离子相结合 在没有其他盐类干扰时 蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为蛋白质的等离子点 蛋白质分子的形状 测定蛋白质分子的形状或构象 最精确的方法是X射线晶体结构分析 但这种方法只能测定晶体状态的蛋白质空间结构 对于溶液中的蛋白质分子的形状 只能借助间接的方法来描述蛋白质分子构象的轮廓 蛋白质的分离纯化方法 分子大小 透析和超过滤 透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离 超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离 密度梯度离心 蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时 质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快 且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时 即停止不前 最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带 凝胶过滤 即分子排阻层析 凝胶颗粒内部为多孔的网状结构 大分子最先流出层析柱 溶解度 等电点沉淀和pH控制 盐溶和盐析 中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度 即盐溶 原因是蛋白质分子吸附盐类离子后 带电层使蛋白质分子彼此排斥 而与水分