基因结构与表达分析的基本策略.ppt

1 基因结构与表达分析的基本策略 StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes 分子生物学系 2 2 分子生物学的三大核心技术 DNA序列分析 DNA测序 1977 聚合酶链式反应 DNA扩增 1985 DNA重组技术 基因克隆 1973 3 一 DNA序列分析 二 核酸分子杂交 三 聚合酶链式反应 四 基因芯片和微阵列 五 Western免疫印迹 主要内容 4 一 双脱氧末端终止法 Sanger 1977 一 DNA序列分析 二 DNA自动化序列分析 三 化学降解法 Gilbert 1977 5 FrederickSanger1918 WalterGilbert1932 TheNobelPrizeinChemistry1980 PaulBerg1926 6 DNA测序技术基础 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 技术 可分离差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段 7 一 双脱氧末端终止法 dideoxychaintermination 8 ATP dATP和ddATP的结构 ATP A OH OH H H dATP ddATP NTP 核苷三磷酸ATP GTP CTP UTP的合称 dNTP 脱氧核苷三磷酸dATP dGTP dCTP dTTP ddNTP ddATP ddGTP ddCTP ddTTP 9 掺入N个核苷酸 DNA合成反应模式图 10 DNA单链模板 引物 掺入ddNTP 延伸的新合成链 末端终止 11 1 双脱氧末端终止法原理 DNA合成反应中 ddNTP不存在3 OH末端 故不能与下一个核苷酸的5 磷酸基团形成3 5 磷酸二酯键 导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 12 ddCTP ddATP ddTTP ddGTP dCTP dATP dTTP dGTP AGCT 5 T 4 7 11 GAATGA3 A C G C T 13 2 DNA测序主要步骤 14 G反应管 T反应管 15 16 GATC 17 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 单链DNA模板的制备 DNA模板与测序引物退火 掺入法标记反应 延伸 终止反应 放射自显影 阅读测序结果 测序步骤 18 二 DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物 替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础 19 ddCTP ddATP ddTTP ddGTP dCTP dATP dTTP dGTP 20 21 表示一个SNP位点 该位点出现了双峰 对应的核苷酸分别为C和T 因此该位点为CT杂合型 如果该位点只有一个峰C或者T 则该位点基因型为CC或TT纯合型 22 DNA自动测序步骤 4种不同荧光染料标记终止物ddNTPs Sanger测序反应 反应产物同一泳道电泳分离 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子 发射出四种不同波长的荧光 荧光信号采集 计算机分析与DNA自动排序 23 DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries 24 25 26 化学降解G反应模式图 Met Met Met Met 27 最新测序技术 454技术 Roche 焦磷酸测序 Pyrosequencing Solexa测序技术 Illumina SOLiD技术 ABI 连接法测序 28 举例 Solexa测序 HiSeq2000 29 Solexa测序 在一个反应中同时加入4种核苷的标签 采用边合成边测序 SBS sequencingbysynthesis 完成人类基因组草图不同测序仪的比较图 30 二 核酸分子杂交 NucleicAcidHybridization 一 Southern印迹杂交 检测DNA Southernblothybridization SouthernEM 1975 二 Northern印迹杂交 检测RNA Northernblothybridization StarkGR 1977 31 核酸分子杂交原理 标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链 应用 核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析 32 33 33 印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上 使之成为固相化分子 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹 因此称之为 blotting 译为印迹技术 34 34 探针技术用放射性核素 生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 探针 探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合 判断是否有同源的核酸分子存在 35 Southern印迹杂交原理 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上 然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程 一 Southern印迹杂交 应用 DNA 基因组DNA 分子的定性或定量分析 36 1 制备基因组DNA2 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA3 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段4 凝胶预处理 如强碱 DNA双链变为单链 5 Southern印迹转移6 标记核酸探针 探针与DNA片段杂交7 杂交结果显示 Southern印迹杂交基本过程 37 Southern印迹杂交示意图 38 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上 然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程 39 40 地中海贫血的Southernblot基因诊断 1 仅一条染色体上的一个 基因缺失或缺陷 则 链的合成部分受抑制 称为 地贫 2 每条染色体上的2个 基因均缺失或缺陷 称为 0地贫 3 1 2序列基本一致 基因不同程度的缺失可引起不同类型的 地中海贫血 1 2 0 0 0 0 41 BamHI BamHI 2 1 2 10kb 14kb 地中海贫血的直接基因诊断 42 正常缺1缺2缺3缺4 14kb 10kb 43 二 Northern印迹杂交 Northernblothybridization 指将RNA变性及电泳分离后 并转移到固相支持物上 用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小 用于mRNA进行定性和定量分析 44 RNA琼脂糖凝胶电泳 Northernblothybridization 应用举例 45 Northernblot杂交分析mRNA的表达 靶mRNA 3 磷酸甘油醛脱氢酶 46 46 三 其他杂交技术 1 斑点杂交 dotblothybridization 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上 用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究 47 47 2 原位杂交 insituhybridization 用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交 可对核酸进行定性 定位和相对定量分析 48 3 核酸酶S1保护分析法 nucleaseS1protectionassay 单链DNA探针与待测RNA形成DNA RNA杂交双链 加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链 DNA RNA杂交双链则受到保护而不被降解 49 4 RNA酶保护分析法 RNaseprotectionassay RPA 50 RPA基本程序 待测RNA的分离 体外转录标记RNA探针 待测RNA与探针RNA进行液相杂交 RNA酶消化 不同大小杂交片段凝胶电泳分离 51 三 聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction PCR 一 PCR技术原理 二 耐热DNA聚合酶 三 PCR引物及设计原则 四 PCR条件的优化 五 PCR改进技术 六 其它PCR技术 52 聚合酶链式反应 PCR 一 PCR技术原理 53 ThereplicationofDNA 54 原理 PCR是模拟天然DNA复制过程 利用DNA聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术 其主要热循环过程为 变性 退火 延伸三个步骤 55 1 PCR循环由三步组成 变性 denaturation 退火 annealing 延伸 extension 高温 合适温度 合适温度 56 57 58 2 PCR扩增终产物大小 介于两条退火引物5 末端之间的双链DNA片段 循环一 59 循环二 60 循环三 61 一对引物 正向和反向限制了PCR扩增的片段的范围 62 5 CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGCAGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCGAGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG3 GGTCCAGTACTACTACCCGT AGAACATGGTGCGCAGGTT 3 引物设计实例 63 Y A 1 E nY 扩增产物的量A 最初靶DNA分子数E PCR扩增效率n 循环次数 3 PCR产量 当E 100 A 1时Y 2n 2n 引物延伸产物的量 64 二 平台期与平台效应 1 平台效应 plateaueffect PCR经过一定数量的循环后 DNA片段不再呈指数累积 而是进入线性增长期或静止期 即平台效应 影响因素 引物及dNTP底物浓度降低 酶与模板比例下降 65 PCR平台效应 66 二 耐热DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 实现了PCR自动化 从嗜热水生菌thermusaquaticsYT 1株中直接分离出来 95 的半衰期 40min 最适温度 72 80 催化反应速率 150 300核苷酸 秒 酶分子 67 68 TaqDNA聚合酶特性 5 3 聚合酶活性 5 3 外切酶活性 较弱的非模板依赖性 缺乏3 5 外切酶活性 69 PCRthermalcycler 70 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 500bp 400bp 200bp 300bp 1000bp 600bp 700bp 800bp 900bp Marker PCR产物 71 无机离子及抑制剂的影响 TaqDNA聚合酶的活性对Mg2 浓度和单价离子 K 或NH4 的性质和浓度较敏感 最适Mg2 浓度 2mmol LK 浓度 50mmol L 72 几种高保真的耐热DNA聚合酶 1 TthDNA聚合酶2 VentDNA聚合酶3 PfuDNA聚合酶 73 三 PCR引物设计原则 引物的化学本质是什么 单链寡核苷酸DNA或RNA片段 DNA复制引物 单链RNA片段 PCR引物 单链DNA片段 74 PCR引物设计原则 1 引物与模板的序列要完全互补2 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应 错配 75 5 CACTGAACGTAGGCCT3 3 GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5 特异扩增 5 CACTGAACGTAGGCCT3 3 GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5 错误引发 1 引物与模板的序列要紧密互补 2 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应 错配 76 引物之间应避免3 端互补 3 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 77 引物自身不应形成发夹结构 78 4 其它原则 引物长度 10 30nt 碱基分布 A T G C随机分布 G C含量 40 60 Tm 4 G C 2 A T 引物3 末端碱基 最好选T C G 不选A 避免出现3个以上的连续碱基 如GGG或CCC 引物5 末端碱基可不与模板DNA互补 79 1A260oligoDNA 33 gN 引物碱基数X 合成的oligoDNAA260单位Y 引物的pmol数 106Y pmol X 33 330 NX 105N 2 引物用量计算 80 模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2 退火 变性 延伸 PCR反应 81 四 PCR条件的优化 1 TaqDNA聚合酶浓度 1 0 2 5U 100 l反应液 2 dNTP浓度 20 200 mol L 3 Mg2 浓度 0 5 2 5mmol L 4 引物浓度 0 1 0 5 mol L 82 五 PCR改进技术 1 RT PCR reversetranscriptionPCR 以mRNA为模板逆转录合成cDNA 再以此cDNA为模板进行PCR反应 83 RT PCR原理 84 逆转录酶 AMV avianmyeloblastosisvirus 酶活性最适温度42 MMLV Moloneymurineleukemiavirus 最适温度37 85 2 定量RT PCR QRT PCR 半定量RT PCR 以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA 在不同引物对引导下共同PCR扩增 看家 基因和目的基因cDNA 86 选择内对照基因组织中普遍表达 表达量比较恒定的 看家 基因mRNA 如GAPDH和 actinmRNA等 半定量标准计算PCR产物 靶cDNA GAPDHcDNA 87 KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析 88 89 3 实时荧光定量RT PCRReal timefluorescentquantitative PCR FQ PCR PCR扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量 应用 用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析 90 荧光染料 91 92 每形成一个DNA双链 就有一定数量的染料结合上去 染料一结合就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比 93 TaqManProbe 一种水解式荧光标记探针 寡核苷酸探针的5 端标记一个荧光报告基团 reporter 3 端标记一个荧光淬灭基团 quencher 94 每产生一条DNA链 就切断一条探针 每切断一条探针 就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 95 分子信标探针 MolecularBeaconProbe 该探针具有发夹结构 5 端标记荧光报告基团 3 端标记淬灭基团 96 探针与靶序列杂交结合 报告荧光染料与淬灭染料分离 发出荧光 97 实时荧光定量PCR计算原理 PCR扩增效率的差异使相同的样品最终产量有很大差异 98 99 CT或Tc或Ct值 临界点循环 Thresholdcycle 即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数 100 101 传染病诊断 监测与疗效预后评估 揭示疾病发病机制 102 荧光定量PCR仪带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪