JAP-087 联苯肼酯检测方法(畜产品)

联苯肼酯检测方法 畜产品 1 分析目标化合物 联苯肼酯 异丙基 2 4 甲氧苯基 3 基 以下称 联苯肼酯氧化 物 4 羟基联苯 以下称 HBP 4 硫酸根联苯 以下称 HBP硫酸结合物 2 仪器设备 高效液相色谱 质谱仪 LC MS 3 试剂 除下列试剂外 使用附录2所列试剂 L 抗坏血酸 特级 1 5 二苯卡巴肼 以下称 DPH 特级 联苯肼酯标准品 含联苯肼酯99 以上 熔点为120 121 HBP标准品 含HBP99 以上 4 试验溶液的制备 1 提取方法 肌肉 脂肪 肝脏 肾脏和其它可食用部分 搅碎混合均匀后 称取其20 0g 奶 称取20 0g样品 加入100mL含0 25 乙酸的乙腈 水 7 3 混合溶液 均质3分钟后 以每分钟 3 000转离心分离 上清液用玻璃纤维滤纸过滤后 离心管内的残留物中加入50 mL 含0 25 乙酸的乙腈 水 7 3 混合溶液均质后 上清液按上述同样过滤 合并所 得的溶液于200mL容量瓶中 加入含0 25 乙酸的乙腈 水 7 3 混合溶液 定容 至200mL 2 净化方法 联苯肼酯和联苯肼酯氧化物的试验溶液 十八烷基甲硅烷基化硅胶柱色谱法 在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱 500 mg 中各注入乙腈和水 弃去流出液 在20mL 1 所得的提取溶液 相当于2g样品 中加入40mL水 注入柱中后 用10mL 乙腈 水 3 7 混合溶液洗涤容器 洗涤液注入柱中 弃去流出液 再用20mL 2 抗坏血酸 乙腈 2 3 混合溶液 收集溶出液于50mL茄型瓶中 还原处理 将 的溶出液在50 塞紧加温30分钟 冷却后 加入1mL 含0 1 DPH的乙腈溶 液 活性炭柱色谱法 在活性炭小柱 500mg 中各注入10 mL含0 01 DPH的乙腈溶液和水 弃去流 出液 柱中注入 所得的溶液后 用5mL含0 01 DPH的乙腈溶液 水 3 2 混 合溶液洗涤容器 洗涤液注入前面的柱中 弃去流出液 再注入25mL含0 01 DPH 的乙腈溶液 溶出液在40 以下浓缩 除去溶剂 残留物中加入2mL含0 05 DPH 的乙酸乙酯溶液 残留物完全溶解后 加入8mL正己烷 酰胺丙基甲硅烷基化硅胶柱色谱法 在酰胺丙基甲硅烷基化硅胶小柱 360mg 中注入10mL含0 05 DPH的乙酸乙酯 正己烷 1 4 混合溶液 弃去流出液 柱中注入 所得的溶液后 用5mL含0 05 DPH 的乙酸乙酯 正己烷 1 4 混合溶液洗涤容器 洗涤液注入前面的柱中 重复操 作二次 全部溶出液在40 以下浓缩 除去溶剂 残留物溶解在0 02 抗坏血酸 乙腈 2 3 混合溶液中 准确至4mL作为试验溶液 b HBP和HBP硫酸结合物的试验溶液 脂肪以外 HBP的转化 移取20 mL 1 所得溶液 相当于2 g样品 于100mL茄型瓶中 加入2 mL盐酸后 在50 塞紧加温2小时 十八烷基甲硅烷基化硅胶柱色谱法 乙二胺 N 正丙基甲硅烷基硅胶柱色谱法和 二乙烯苯 N 乙烯基吡咯烷酮共聚物柱色谱法 在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱 500mg 乙二胺 N 正丙基甲硅烷基硅胶小 柱 500mg 和二乙烯苯 N 乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱 200mg 中 分别注入10 mL 乙腈和水 弃去流出液 在 所得的溶液中加入水40 mL 注入十八烷基甲硅烷基化 硅胶小柱后 用10mL乙腈 水 1 3 的混合溶液洗涤容器 洗涤液注入柱中 弃 去流出液 接着在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱下面连接乙二胺 N 正丙基甲硅烷基 硅胶小柱和二乙烯苯 N 乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱 注入10mL乙腈 水 1 1 混合溶液 弃去流出液 除去十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱和乙二胺 N 正丙基甲硅 烷基硅胶小柱后 在二乙烯苯 N 乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱中注入25mL乙腈 溶 出液在40 以下浓缩 除去溶剂 残留物中溶解乙腈 水 1 1 混合溶液中 准 确至4mL作为试验溶液 5 标准曲线的制作 用0 02 抗坏血酸 乙腈 2 3 混合溶液将联苯肼酯标准品配制成0 004 0 08 mg L 的溶液数点和用乙腈 水 1 1 混合溶液将HBP配制成0 002 0 04 mg L的 溶液数点 分别注入10 L于LC MS中 用峰高法或面积法绘制成标准曲线 6 定量试验 注入10 L试验溶液于LC MS中 根据5的标准曲线求出联苯肼酯和HBP的含量 按下式 求得包括HBP的联苯肼酯的含量 联苯肼酯 包括HBP mg kg A B 1 76 A 联苯肼酯的含量 mg kg B HBP的含量 mg kg 7 测定条件 检测器 LC MS 柱 十八烷基甲硅烷基化硅胶 粒径3 m 内径2mm 长150mm 柱温 40 流动相 联苯肼酯 乙腈 0 1 乙酸溶液的混合溶液由 1 1 到 9 1 的浓度梯度 运行5分钟 在 9 1 保持10分钟 HBP 乙腈 0 1 乙酸溶液的混合溶液由 4 6 到 9 1 的浓度梯度运行5分钟 在 9 1 保持10分钟 离子化方式 ESI 主离子 m z 联苯肼酯 正离子方式 301 6 HBP 负离子方式 169 进样量 10 L 保留时间 联苯肼酯 约7 6分 HBP 约7 7分 8 定量限 联苯肼酯 0 008 mg kg HBP 0 004 mg kg 9 注意事項 根据样品的种类使分析目标有所差异 脂肪样品以联苯肼酯和联苯肼酯氧化物作为 分析目标 脂肪以外的样品以联苯肼酯 联苯肼酯氧化物 HBP和HBP硫酸结合物作 为分析目标 1 分析值 对联苯肼酯及其代謝物 HBP 分别进行定量 将 HBP 的含量乘系数换算成联苯肼酯的 含量 它们的和为分析值 2 检测方法概述 脂肪以外的样品测定 的分析目标化合物 脂肪样品测定 的分析目标化合物 联苯肼酯和联苯肼酯氧化物 本方法用含0 25 乙酸的乙腈 水 7 3 混合溶液从样品中提取 用十八烷基 甲硅烷基化硅胶小柱净化后 经还原处理将联苯肼酯氧化物一次性转换成联苯肼酯 再用活性炭小柱和酰胺丙基甲硅烷化硅胶小柱净化后 LC MS测定 HBP和HBP硫酸结合物 本方法用含0 25 乙酸的乙腈 水 7 3 混合溶液从样品中提取 将HBP硫酸结 合物一次性转换成HBP后 用十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱 乙二胺 N 正丙基甲硅 烷基硅胶小柱和二乙烯苯 N 乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱净化后 LC MS测定 3 注意点 用十八烷基甲硅烷基硅胶小柱净化时 当小柱的孔堵住的时候 在小柱上部 填塞脱脂棉有效果 联苯肼酯净化用的 2 抗坏血酸溶液 0 02 抗坏血酸溶液 含 0 1 DPH 的乙腈溶液 含 0 01 DPH 的乙腈溶液和含 0 05 DPH 的乙酸乙酯溶液必须用时配 制 特别是含有 DPH 的溶液配制后立即使用 在酰胺丙基甲硅烷化硅胶色谱法净化联苯肼酯时 注入小柱前的残留物很难溶 于正已烷 必须在含 0 05 DPH 的