《色谱分析导论》PPT课件.ppt

第十一章色谱法导论 11 1概述色谱法是一种分离技术 这种分离技术应用于分析化学 就是色谱分析 它适用于有机混合物的分离提纯和分析测定 在中药分析领域有着广泛的用途 由于同学们对色谱这个名词很陌生 先举一个例子 对色谱分析的整个过程作一简单说明 一 色谱法定义基于物质各种物理化学的性质的微小差异 使组分在流动相和固定相两相之间的分布系数不同 而当两相作相对运动时 组分在两相间进行连续多次分配 实现组分分离 达到彼此分离的目的 通常根据根据以下几种性质的差异 溶解度分子极性分子大小吸附力交换能力立体结构 二 色谱法简介早在1903年由俄国植物学家 分离植物色素时首先采用 后来不仅用于分离有色物质 还用于分离无色物质 并出现了种类繁多的各种色谱法 1941年Martin和Synge发明了气相色谱 从色谱过程的热力学角度出发 提出了塔板理论 1952年获得诺贝尔化学奖 1956年荷兰学者VanDeemter从从色谱过程的动力学角度出发 提出了速率理论 目前色谱法已广泛应用于许多领域 成为十分重要的分离分析手段 二 色谱过程的特点1任何色谱过程 都具有两个相 不动的一相 称一为固定相 另一相是携带样品流过固定相的流动体 称为流动相 2当流动相中样品混合物经过固定相时 就会与固定相发生作用 由于各组分在性质和结构上的差异 与固定相的作用力不同 因此固定相滞留时间长短不同 从而达到分离 14 2色谱法分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱 GC 根据固定相是固体吸附剂还是固定液 附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体 又可分为气固色谱 GSC 和气液色谱 GLC 液体为流动相的色谱称液相色谱 LC 同理 液相色谱亦可分为液固色谱 LSC 和液液色谱 LLC 1 按两相状态分类 2 按分离机理分类 利用组分在吸附剂 固定相 上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法 称为吸附色谱法 利用组分在固定液 固定相 中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法 利用组分在离子交换剂 固定相 上的亲和力大小不同而达到分离的方法 称为离子交换色谱法 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法 称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法 最近 又有一种新分离技术 利用不同组分与固定相 固定化分子 的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法 常用于蛋白质的分离 3 按固定相的外形分类固定相装于柱内的色谱法 称为柱色谱 固定相呈平板状的色谱法 称为平板色谱 它又可分为层色谱和纸色谱 11 3色谱流出曲线及有关术语一 流出曲线和色谱峰 如果进样量很小 浓度很低 在吸附等温线的线性范围内 色谱峰如果对称 可用Gauss正态分布函数表示 式中 C 不同时间t时某物质的浓度 C0 进样浓度 tr 保留时间 标准偏差 二 基线 是柱中仅有流动相通过时 检测器响应讯号的记录值 稳定的基线应该是一条水平直线 三 峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离 以h表示 四 保留值 1 死时间tM不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时 从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间 因为这种物质不被固定相吸附或溶解 故其流动速度将与流动相的流动速度相近 测定流动相平均线速 时 可用柱长L与tM的比值计算 2 保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间 称为保留时间 它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间 3 调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间 即tR tR tM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间 所以tR 实际上是组份在固定相中停留的总时间 保留时间可用时间单位 如s 或距离单位 如cm 表示 保留时间是色谱法定性的基本依据 但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响 因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定 4 死体积VM指色谱柱在填充后 柱管内固定相颗粒间所剩留的空间 色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和 当后两项很小而可忽略不计时 死体积可由死时间与流动相体积流速F0 L min 计算 VM tM F0 5 保留体积VR指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积 保留体积与保留时间t 的关系如下 VR tR F0 6 调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后 称该组份的调整保留体积 即VR VR VM 7 相对保留值 2 1某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比 称为相对保留值 选择因子在定性分析中 通常固定一个色谱峰作为标准 s 然后再求其它峰 i 对这个峰的相对保留值 此时 ri s可能大于1 也可能小于1 在多元混合物分析中 通常选择一对最难分离的物质对 将它们的相对保留值作为重要参数 在这种特殊情况下 可用符号 表示 式中tR2 为后出峰的调整保留时间 所以这时 总是大于1的 五 区域宽度色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数 它反映了色谱操作条件的动力学因素 度量色谱峰区域宽度通常有三种方法 1 标准偏差 即0 607倍峰高处色谱峰宽的一半 2 半峰宽W1 2即峰高一半处对应的峰宽 它与标准偏差 的关系是 W1 2 2 354 3 基线宽度W即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距 它与标准偏差 的关系是 W 4 从色谱流出曲线上 可以得到许多重要信息 1 根据色谱峰的个数 可以判断样品中所合组份的最少个数 2 根据色谱峰的保留值 或位置 可以进行定性分析 3 根据色谱峰下的面积或峰高 可以进行定量分析 4 色谱峰的保留值及其区域宽度 是评价色谱柱分离效能的依据 5 色谱峰两峰间的距离 是评价固定相 和流动相 选择是否合适的依据 11 4色谱法分析的基本原理色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离 组分要达到完全分离 两峰间的距离必须足够远 两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的 即与色谱过程的热力学性质有关 但是两峰间虽有一定距离 如果每个峰都很宽 以致彼此重叠 还是不能分开 这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的 即与色谱过程的动力学性质有关 因此 要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为 一 分配系数K和分配比k 1 分配系数K分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程 而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程 这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述 而描述这种分配的参数称为分配系数见它是指在一定温度和压力下 组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值 即 2 分配比k 分配比又称容量因子 它是指在一定温度和压力下 组分在两相间分配达平衡时 分配在固定相和流动相中的质量比 即 k值越大 说明组分在固定相中的量越多 相当于柱的容量大 因此又称分配容量或容量因子 它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数 k值也决定于组分及固定相热力学性质 它不仅随柱温 柱压变化而变化 而且还与流动相及固定相的体积有关 式中Cs Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度 Vm为柱中流动相的体积 近似等于死体积 Vs为柱中固定相的体积 在各种不同的类型的色谱中有不同的含义 例如 在分配色谱中 Vs表示固定液的体积 在尺寸排阻色谱中 则表示固定相的孔体积 3 分配系数K与分配比k的关系 其中 称为相比率 它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数 例如 对填充柱 其 值一般为6 35 对毛细管柱 其 值为60 600 二 塔板理论最早由Martin等人提出塔板理论 把色谱柱比作一个精馏塔 沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为 同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标 该理论假定 i 在柱内一小段长度H内 组分可以在两相间迅速达到平衡 这一小段柱长称为理论塔板高度H ii 以气相色谱为例 载气进入色谱柱不是连续进行的 而是脉动式 每次进气为一个塔板体积 Vm iii 所有组分开始时存在于第0号塔板上 而且试样沿轴 纵 向扩散可忽略 iv 分配系数在所有塔板上是常数 与组分在某一塔板上的量无关 为简单起见 设色谱往由5块塔板 n 5 n为柱子的塔板数 组成 并以r表示塔板编号 r 1 2 n l 某组分的分配比k 1 为简单起见 设色谱往由5块塔板 n 5 n为柱子的塔板数 组成 并以r表示塔板编号 r 1 2 n l 某组分的分配比k 1 根据上述假定 在色谱分离过程中 该组分的分布可计算如下 开始时 若有单位质量 即m 1 例1 g 的该组分加到第0号塔板上 分配平衡后 由于k 1 即ns nm故nm ns 0 5 当一个板体积 l V 的载气以脉动形式进入0号板时 就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上 此时0号板液相 或固相 中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分 将各自在两相间重新分配 故0号板上所含组分总量为0 5 其中气液 或气固 两相各为0 25而1号板上所含总量同样为0 5 气液 或气固 相亦各为0 25 以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时 上述过程就重复一次 见下图 按上述分配过程 对于n 5 k 1 m 1的体系 随着脉动进入柱中板体积载气的增加 组分分布在柱内任一板上的总量 由塔板理论可建流出曲线方程 m为组分质量 VR为保留体积 n为理论塔板数 当V VR时 C值最大 即 由流出曲线方程可推出 而理论塔板高度 H 即 从上两式可以看出 色谱峰W越小 n就越大 而H就越小 柱效能越高 因此 n和H是描述柱效能的指标 通常填充色谱柱的n 103 H 1mm 而毛细管柱n 105 106 H 0 5mm由于死时tm包括在tR中 而实际的tm不参与柱内分配 所计算的n值尽大 H很小 但与实际柱效能相差甚远 所以 提出把tm扣除 采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能 塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程 导出流出曲线的数学模型 并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置 还提出了计算和评价柱效的参数 但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程 例如 纵向扩能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素 也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数 这就限制了它的应用 三 速率理论 1956年荷兰学者vanDeemter等在研究气液色谱时 提出了色谱过程动力学理论 速率理论 他们吸收了塔板理论中板高的概念 并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素 该理论模型对气相 液相色谱都适用 vanDeemter方程的数学简化式为 式中u为流动相的线速度 A B C为常数 分别代表涡流扩散项系数 分子扩散项系数 传质阻力项系数 现分别叙述各项系数的物理意义 1 涡流扩散项A 在填充色谱柱中 当组分随流动相向柱出口迁移时 流动相由于受到固定相颗粒障碍 不断改变流动方向 使组分分子在前进中形成紊乱的类似 涡流 的流动 故称涡流扩散 形象地如图所示 A 2 dp 上式表明 A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子 有关 与流动相的性质 线速变和组分性质无关 为了减少涡流扩散 提高柱效 使用细而均匀的颗粒 并且填充均匀是十分必要的 对于空心毛细管 不存在涡流扩散 因此A 0 2 分子扩散项B u 纵向扩散项 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的 组分从柱人口加入 其浓度分布的构型呈 塞子 状 如图所示 它随着流动相向前推进 由于存在浓度梯度 塞子 必然自发地向前和向后扩散 造成谱带展宽 分子扩散项系数为 B 2 Dg 式中 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素 也称弯曲因子 它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况 Dg为组分在流动相中扩散系数 cm2 s 1 3 传质阻力项Cu 由于气相色谱以气体为流动相 液相色谱以液体为流动相 它们的传质过程不完全相同 现分别讨论之 l 对于气液色谱 传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项 即C Cg Cl 气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程 这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换 即进行浓度分配 有的分子还来不及进入两相界面 就被气相带走 有的则进人两相界面又来不及返回气相 这样 使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡 引起滞后现象 从而使色谱峰变宽 对于填充柱 气相传质阻力系数Cg为 式中k为容量因子 由上式看出 气相传质阻力与填充物粒度则的平方成正比 与组分在载气流中的扩散系数见成反比 因此 采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体 如氢气 做载气 可他Cg减小 提高柱效 液相传质阻力系数C1为 由上式看出 固定相的液膜厚度df薄 组分在液相的扩散系数D1大 则液相传质阻力就小 降低固定液的含量 可以降低液膜厚度 但k值随之变小 又会使C1增大 当固定液含量一定时 液膜厚度随载体的比表面积增加而降低 因此 一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度 但比表面太大 由于吸附造成拖尾峰 也不利分离 虽然提高柱温可增大Dl 但会使k值减小 为了保持适当的Cl值 应控制适宜的柱温 将上面式总结 即可得气液色谱速率板高方程 这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义 它指出了色谱柱填充的均匀程度 填料颗粒的大小 流动相的种类及流速 固定相的液膜厚度等对柱效的影响 2 对于液液分配色谱 传质阻力系数 C 包含流动相传质阻力系数 Cm 和固定相传质系数 Cs 即C Cm Cs其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力 即 式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力 当流动相流过色谱柱内的填充物时 靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些 故柱内流动相的流速是不均匀 m是由柱和填充的性质决定的因子 sm是一常数 它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关 液液色谱中固定相传质阻力系数 Cs 可用下式表示 该式与气液色谱速率方程的形式基本一致 主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计 影响柱效的主要因素是传质阻力项 综上所述 对液液色谱的VanDeemter方程式可表达为 4 流动相线速度对板高的影响 1 LC和GC的H u图表明 对于一定长度的柱子 柱效越高 理论塔板数越大 板高越小 但究竟控制怎样的线速度 才能达到最小板高呢 根据vanDeemter公式分别作LC和GC的H u图 见图a b 由图a和 b 不难看出 LC和GC的H u图十分相似 对应某一流速都有一个板高的极小值 这个极小值就是柱效最高点 LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上 说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级 说明对于LC 为了取得良好的柱效 流速不一定要很高 2 分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献 5 固定相粒度大小对板高的影响 固定相粒度对板高的影响是至关重要的 实验表明不同粒度 H u曲线也不同 粒度越细 板高越小 并且受线速度影响亦小 这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据 当然 固定相颗粒愈细 柱流速愈慢 只有采取高压技术 流动相流速才能符合实验要求 11 4分离度 图说明了柱效和选择性对分离的影响 图中 a 两色谱峰距离近并且峰形宽 两峰严重相叠 这表示选择性和柱效都很差 图中 b 虽然两峰距离拉开了 但峰形仍很宽 说明选择性好 但技效低 图中 c 分离最理想 说明选择性好 柱效也高 由此可见 单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况 故需引人一个综合性指标 分离度R 分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标 称总分离效能指标 分离度又叫分辨率 它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值 即 R值越大 表明相邻两组分分离越好 一般说 当R 1时 两峰有部分重叠 当R 1时 分离程度可达98 当R 1 5时 分离程度可达99 7 通常用R 1 5作为相邻两组分已完全分离的标志 下图表示了不同分离度时色谱峰分离的程度 11 5基本色谱分离方程式分离度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素 实际上 分离度受柱效 n 选择因子 和容量因子 k 三个参数的控制 对于难分离物质对 由于它们的分配系数差别小 可合理地假设k1 k2 k W1 W2 W 由上式 得 后式即为基本色谱分离方程式 在实际应用中 往往用neff 代替n 处理上式可得 可以看出 后者为基本色谱分离方程式又一表达式 1 分离度与柱效的关系 由分离方程式看出 具有一定相对保留值 的物质对 分离度直接和有效塔板数有关 说明有效塔板数能正确地代表柱效能 而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响 当固定相确定 被分离物质对的 确定后 分离度将取决于n 这时 对于一定理论板高的柱子 分离度的平方与柱长成正比 即 虽说用较长的柱可以提高分离度 但延长了分析时间 因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子 通过降低板高 以提高分离度 2 分离度与选择因子的关系由基本色谱方程式判断 当 1时 R 0 这时 无论怎样提高柱效也无法使两组分分离 显然 大 选择性好 研究证明 的微小变化 就能引起分离度的显著变化 一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温 可有效增大 值 3 分离度与容量因子的关系 如果设 则分离方程式写成 由几R Q k的曲线图 图d3 看出 当k 1O时 随容量因子增大 分离度的增长是微乎其微的 一般取k为2 10最宜 对于GC 通过提高温度 可选择合适的k值 以改进分离度 而对于LC 只要改变流动相的组成 就能有效地控制k值 它对LC的分离能起到立竿见影的效果 见图d4 4 分离度与分析时间的关系下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系 从上式 设 则可得 由图d3中R Q或tr Q 对k的曲线可见 当k在2 5时 可在较短的分析时间 取得良好的分离度 5 基本色谱分离方程式的应用在实际中 基本色谱分离方程式是很有用的公式 它将柱效 选择因子 分离度三者的关系联系起来了 知道其中两个指标 就可计算出第三个指标 例11 1 有一根lm长的柱子 分离组分1和2得到如图d5的色谱图 图中横坐标l为记录笔走纸距离 若欲得到R 1 2的分离度 有效塔板数应为多少 色谱往要加到多长 解 先求出组分2对组分1的相对保留值r2 1 即 值 求有效塔板数neffneff 16 0 8 2 1 1 1 1 1 2 1239若使R 1 2 所需塔板数可计算 即 因此 欲使分离度达到1 2 需有效塔板数为2788块