专题5课题1DNA的粗提取与鉴定.ppt

5 1DNA的粗提取与鉴定 一 基础知识 一 提取DNA的方法 1 提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法 分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2 提取DNA的基本思路 提取DNA 去除其他成分利用DNA与RNA 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异 DNA在NaCl溶液中的溶解性 DNA和蛋白质等成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点 选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解 而使杂质沉淀 或者让其他成分溶解 DNA析出 3 DNA等大分子的理化性质 DNA不溶于酒精溶液 DNA对酶 高温和洗涤剂的耐受性 DNA不溶于酒精溶液 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精 将DNA与蛋白质进一步分离 DNA不溶于酒精溶液 DNA对酶 高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶 水解蛋白质 对DNA没有影响 高温 大多数蛋白质不能忍受60 80 而DNA在80 以上才会变性 洗涤剂 溶解细胞膜 去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响 试剂 二 DNA的鉴定 条件 二苯胺 沸水浴条件下 DNA遇二苯胺被染成蓝色 沸水浴 现象 还可以用什么试剂 甲基绿 DNA 绿色 一 实验材料的选取 二 破碎细胞 获取含DNA的滤液 三 除去滤液中的杂质 纯化 四 DNA的析出与鉴定 二 实验设计 一 实验材料的选取 从下列材料中选取2 3种 原则 菜花 香蕉 猕猴桃 洋葱 豌豆 菠菜 鱼卵 猪肝 鸡血 哺乳动物的红细胞 在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑选用DNA含量相对较高且易破碎的组织 从核DNA数目来看 猪38条 鸡78条 哺乳动物红细胞0条 猕猴桃58条 洋葱16条 豌豆14条 菠菜12条 大肠杆菌1条 请选择动植物材料各一种 哺乳动物的红细胞无细胞核及细胞器 液体培养基中的大肠杆菌的DNA量减少 鱼卵是减数分裂的产物 二 破碎细胞 获取含DNA的滤液 1 动物细胞 2 植物细胞 容易破碎 鸡血细胞溶液 加入一定量的蒸馏水 同时用玻璃棒搅拌 过滤后收集滤液 想一想 为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体 水分大量进入血细胞 使血细胞胀裂 加上搅拌作用 加速鸡血细胞细胞膜 核膜破裂 从而释放出DNA 想一想 洗涤剂和食盐的作用分别是什么 洗涤剂 离子去污剂 能溶解细胞膜 利于DNA释放 食盐 NaCl 利于DNA的溶解于研磨液中 加入一定的洗涤剂和食盐 充分的搅拌和研磨 过滤后收集研磨液 2 植物细胞 需要溶解细胞膜 经研磨可破碎细胞壁 使细胞核内的DNA释放 若研磨不充分 会使提取的DNA量变少 导致看不到丝状沉淀物 用二苯胺鉴定不显示蓝色等 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论 滤液 研磨液中可能含有哪些成分 答 可能含有核蛋白 多糖和RNA等杂质 想一想 研磨的目的是什么 如果研磨不充分 会对实验结果产生怎样的影响 三 除去滤液中的杂质 DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解性不同 讨论 为什么反复地溶解与析出DNA 能够去除杂质 答 用高盐浓度的溶液溶解DNA 能除去在高盐中不能溶解的杂质 用低盐浓度使DNA析出 能除去溶解在低盐溶液中的杂质 因此 通过反复溶解与析出DNA 就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 讨论 方案二与方案三的原理有什么不同 方案二 利用蛋白酶分解杂质中的蛋白质 使提取的DNA与蛋白质分开 方案三 利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同 使蛋白质变性 与DNA分离 四 DNA的析出与鉴定 向滤液中加入与滤液体积相等的冷却的酒精溶液 体积分数95 静置2 3min 溶液中会出现白色丝状物 粗提取DNA用玻璃棒沿一个方向搅拌 卷起丝状物 并用滤纸吸取上面的水 1 DNA的析出 2 DNA的鉴定 向两支试管中分别加入2mol LNaCl溶液5ml 向其中一支试管中加入提取到的白色丝状物 并搅拌 向两支试管各加入二苯胺试剂4ml 混匀后 置于沸水浴中加热5min 待冷却后 比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象 溶解丝状物的溶液逐渐变为蓝色 一 案例一 以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取 实验案例 鸡血细胞极易吸水胀破 而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心 对设备要求较高 操作繁琐 历时较长 1 鸡血细胞做实验材料的原因 鸡血细胞核的DNA含量丰富 材料易得 2 实验原理 DNA在NaCl溶液中的溶解度 是随着NaCl的浓度的变化而改变的 当NaCl的物质的量浓度为0 14mol L时 DNA的溶解度最低 利用这一原理 可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出 DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液 利用这一原理 可以进一步提取出含杂质较少的DNA DNA遇二苯胺 沸水浴 会染成蓝色 因此 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 4 课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为0 1g ml的柠檬酸钠溶液 抗凝剂 100ml 置于500ml烧杯中 注入新鲜的鸡血 约180ml 同时用玻璃棒搅拌 使血液与柠檬酸纳溶液充分混合 以免凝血 将烧杯中的血液置于冰箱内 静置一天 使血细胞自行沉淀 或将血液倒入离心管内 用1000r min 转每分 的离心机离心2min 血细胞沉淀于离心管底部 实验时 用吸管除去上部的澄清液 血浆 就可以得到鸡血细胞液 过程 柠檬酸钠作用 防止血液凝固 作用机理 柠檬酸钠能与血浆中的Ca2 发生反应 生成柠檬酸钙络合物 血浆中游离的Ca2 大大减少 血液就不会凝固 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA 容易被玻璃容器吸附 所以在提取过程中为了减少DNA的损失 最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液 注意事项 讨论 提取鸡血中的DNA时 为什么除去血液中的上清液 答 血液分为两部分 一部分是血浆 一部分是血细胞 离心后除去的上清液是血浆 血浆中不含DNA 5 方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5mL 10mL 注入到50mL烧杯中 向烧杯中加入蒸馏水20mL 同时用玻璃棒沿一个方向充分搅拌5min 使血细胞加速破裂 然后 用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL 取其滤液 提取鸡血细胞的细胞核物质 讨论 1 用玻璃棒搅拌有什么意义 答 用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂 注意应沿一个方向快速搅拌 但也不能太快太猛 防止打碎DNA 2 滤去的是什么物质 得到的是什么 答 过滤滤去的是细胞膜和核膜等物质 得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA 溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2mol L的氯化钠溶液40mL加入到滤液中 并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min 使其混合均匀 这时DNA在溶液中呈溶解状态 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水 同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌 这时烧杯中有丝状物出现 注意观察丝状物呈什么颜色 继续加入蒸馏水 溶液中出现的粘稠物会越来越多 当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水 这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0 14mol L 析出含DNA的粘稠物 讨论 加入蒸馏水的目的 降低NaCl溶液浓度到DNA溶解度最低点 使DNA从NaCl溶液中析出 实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水 并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌 以利于DNA分子的附着和缠绕 注意事项 滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗 过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中 含DNA的粘稠物被留在纱布上 将DNA的粘稠物再溶解 取1个50mL烧杯 向烧杯内注入的物质的量浓度为2mol L的氯化钠溶液20mL 用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中 用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌 使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中 过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100mL烧杯 用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液 取其滤液 DNA溶于滤液中 提取含杂质较少的DNA 在上述滤液中 加入等体积冷却的 体积分数为95 的酒精溶液50mL 使用冷却的酒精 对DNA的凝集效果较佳 并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌 溶液中会出现含杂质较少的丝状物 用玻璃棒将丝状物卷起 并用滤纸吸取上面的水分 答 因为DNA不溶于冷酒精 而其他物质可以溶解在酒精中 使含杂质较少的DNA丝状物可以析出 悬浮于溶液中 讨论 2 观察丝状物呈什么颜色 答 白色 1 为什么要加50mL的冷酒精 向两支试管中分别加入2mol LNaCl溶液5ml 向其中一支试管中加入提取到的白色丝状物 并搅拌 向两支试管各加入二苯胺试剂4ml 混匀后 置于沸水浴中加热5min 待冷却后 比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象 溶解丝状物的溶液逐渐变为蓝色 DNA的鉴定 讨论 答 有丝状物的试管变成蓝色 另一试管还是原来颜色 2 这一鉴定结果说明什么问题 1 比较两个试管中溶液的颜色有什么不同 答 提取出的丝状物是DNA 3 DNA的直径约为20 10 10m 实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小 答 DNA分子直径只有2nm 丝状物是多个DNA子聚在一起形成的 答 整个实验共 两次蒸馏水 三次过滤 两次析出 六次搅拌 6 讨论 两次蒸馏水 第一次 第一步 使细胞吸水胀破 释放DNA 第二次 第三步 降低NaCl溶液浓度 使DNA黏稠物析出 1 此实验过程中有几次使用蒸馏水 几次过滤 几次析出 几次搅拌 分别在哪一步 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关 第二次要滤取黏稠物 所以要使用多层纱布 第一次和第三次过滤均要滤液 使用的纱布为1 2层 三次过滤 第一次 第一步DNA存在于滤液里第二次 第四步DNA被留在纱布上第三次 第六步DNA存在于滤液里 两次析出 第一次 用0 14mol L的NaCI溶液 第三步 第二次 用冷却的95 的酒精 第七步 六次搅拌 第一 二 三 五 七 八步 其中除第八步外 其余均要朝一个方向搅拌 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固 使血细胞吸水破裂 释放DNA 溶解DNA 稀释NaCl溶液至0 14mol L 使DNA最大限度地析出 使含DNA的黏稠物留在纱布上 使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中 除去含DNA的滤液中的杂质 析出DNA A出现蓝色B无蓝色 二 案例二 以菜花为实验材料进行DNA的粗提取 1 课前准备 将新鲜菜花和体积分数为95 的乙醇 酒精 溶液放入冰箱冷冻室24h 2 提取DNA的具体步骤 取材 称取30g菜花 去梗取花 切碎 研磨 将碎菜花放入研钵中 倒入10mL研磨液 充分研磨10min 过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布 将菜花研磨液过滤到烧杯中 有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心 用1000r min的转速 离心2 5min 取上清液放入烧杯中 在4 冰箱中放置几分钟后 再取上清液 沉淀 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95 的预冷酒精溶液中 并用玻璃棒缓缓 轻轻地搅拌溶液 玻璃棒不要直插到烧杯底部 沉淀3 5min后 可见白色的DNA絮状物出现 用玻璃棒缓缓旋转 将絮状物缠绕在玻璃棒上 三 操作提示 1 以血液为实验材料时 每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠 防止血液凝固 2 加入洗涤剂后 动作要轻缓 柔和 否则容易产生大量的泡沫 不利于后续步骤的操作 加入酒精和用玻璃棒搅拌时 动作要轻缓 以免加剧DNA分子的断裂 导致DNA分子不能形成絮状沉淀 3 二苯胺试剂要现配现用 否则会影响鉴定的效果 四 课题成果评价 一 是否提取出了DNA 观察你提取的DNA颜色 如果不是白色丝状物 说明DNA中的杂质较多 二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功 如果不呈现蓝色 可能所提取的DNA含量低 或是实验操作中出现错误 需要重新制备 本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白 多糖等杂质 二 分析DNA中的杂质 练习 1 请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的 答 提取DNA的第一步是材料的选取 其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料 否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难 第二步是DNA的释放和溶解 这一步是实验成功与否的关键 要尽可能使细胞内的DNA全部溶解 第三步是DNA的纯化 即根据DNA的溶解特性 对酶及高温的耐受性的不同等特性 最大限度地将DNA与杂质分开 最后一步是对DNA进行鉴定 这是对整个实验的结果的检测 2 你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗 答 提取蛋白质比提取DNA的难度大 这是因为 与DNA相比 蛋白质对温度 盐浓度 pH等条件要敏感得多 很容易失活 并且蛋白质的空间结构多种多样 理化性质各不相同 使得蛋白质的提取没有一种统一的方法 只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件 设计特定的方法 2 实验中NaCl的物质的量浓度为2