转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤.doc

转染细胞的稳定筛选1、药物筛选前的准备药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。2、药物筛选注意事项（1）药筛的时间加药时间一般为转染后48h。但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h空白对照加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。（2）换液如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。3、克隆筛选注意事项 若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。4、稳定克隆筛选步骤（1）有限稀释法步骤a) 将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来b) 对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）c) 计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种d) 然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）e) 待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉，只有一个细胞的孔划勾，以做好标记，如果只有一个细胞的孔数量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾，但这样克隆就可能不纯。f) 等细胞长起来以后，从96孔板到24孔板，再到6孔板逐渐扩大培养g) 细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆并大量培养h) 首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验（2）无限稀释法a) 将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可）用胰酶消化下来b) 对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）c) 计算后，吸出约5000个细胞，铺到10cm的dish中，摇匀d) 待细胞贴壁后，在显微镜下找到单个细胞，用马克笔在dish的底部做好标记，然后放到孵箱里培养e) 待单个细胞长成了细胞团（约10个），在显微镜下观察，如果有两个细胞团靠得很近，则用马克笔在底部做好标记，然后在安全柜内用白枪头刮掉周围舍弃的细胞团，并不断在显微镜下观察，看周围的细胞是否已经都被刮掉。然后换培养液（将刮掉的细胞弃去）f) 放到孵箱里培养数天（细胞团较大，约一两百个），克隆在肉眼下可见g) 将培养液倒掉，用PBS洗两遍，再吸10ul的胰酶在标记好细胞团的地方不停的快速吹打约1-2min，最后将枪头里细胞悬液打到24孔板内培养即为挑出的一个克隆，此过程切记不能过长，以免dish太干导致细胞死亡h) 照7的方法每种细胞至少挑出15个克隆，培养一段时间后，消化到六孔板中培养（处理时间根据24孔板内的细胞数量而定）i) 细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆并大量培养j) 首次验证成功的克隆养两周后再次验