Gateway技术-克隆、表达新方法.ppt

Gateway技术克隆 表达新方法 Gateway技术 Gateway技术 一种克隆操作平台 把目的基因克隆到入门载体 EntryVector 后 就不用依赖限制性内切酶 而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶 高效 快速地将目的基因克隆到其它的受体载体 DestinationVector 目的载体 上 Gateway技术特点 通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间 同时将目的基因转移到多个表达系统 在任何选择的表达系统如细菌 酵母 昆虫 或哺乳动物进行基因的分析表达 Gateway技术的灵活性 Gateway技术的原理Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上 在噬菌体和细菌的整合因子 INF Int 的作用下 lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组 lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中 两侧产生两个新位点 attL和attR 这是一个可逆的过程 如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点 噬菌体从细菌基因组上裂解下来 这一过程的方向是受控于两个重要因素 存在的介导蛋白和重组位点 整合后的附着位点为attL BOP attR POB 整合位点 attBattP切除位点 attLattR整合过程需要Int和IHF共同作用 attBxattP attLxattR 完成构建Gateway表达克隆仅需两步 1 创建入门克隆 通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体 2 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及GatewayLRClonase酶 构建表达克隆 BP和LR反应示意图 BP反应 LR反应 反应特点 入门载体的构建 1 限制性内切酶消化和连接进入入门载体 2 PCR克隆 定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B P重组 PCR定向TOPO克隆 PCR定向TOPO克隆流程一 实验前的准备1 认真阅读INVITROGEN公司的GATEWAY MANUAL2 在实验操作前 先要确保你的基因使用高保真的Taq酶克隆经过验证 装入T载体中3 入门载体质粒和目标表达载体质粒的抽提 质粒的浓度要求比较高 150ng ul 4 引物设计 根据入门载体序列的特点 设计通用引物和含部分接头的基因特异性引物 引物设计 1通用引物 attB1adapter 5 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT 3 attB2adapter 5 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT 3 2含部分接头的基因特异性引物 attB1 geneforward 5 AAAAAGCAGGCTNN template specificsequences 3 attB2 genereverse 5 AGAAAGCTGGGTN template specificsequences 3 BP重组装入入门载体1 添加attB接头的PCR以携带目的基因质粒为模板 加含部分接头的基因特异性引物 进行第一轮PCR2 取第一轮的PCR产物做模板 加入通用引物 进行第二轮3 PCR产物的纯化4 BP重组反应 BP重组反应ComponentsSampleattB PCRproduct 10ng 1 7ulpENTRvector 150ng ul 1ul5XBPClonaseClonaseenzymemix2ulTEBuffer pH8 0to10ul25 温浴1 16h 随着时间的延长 可有效增加克隆 但时间不宜超过18h 终止反应后 最后取1 5ulBP反应液转化大肠杆菌 挑取阳性克隆 进行PCR或验证 然后抽提质粒 酶切验证 LR重组装入表达载体根据自己实验目的 了解自己将要装入的载体的结构 原核表达 超表达 抑制表达 特异表达 GUS GFP表达等载体 LR重组反应ComponentsSampleEntryclone 50 150ng 1 7ulDestinationvector 150ng ul 1ul5XLRClonaseenzymemix2ulTEBuffer pH8 0to10ul25 温浴1 16h 终止反应后 最后取1 5ulBP反应液转化大肠杆菌挑取阳性克隆 进行PCR或验证 然后抽提质粒 酶切验证 Gateway技术的评价一旦构建好Gateway入门克隆 蛋白表达和分析的大门就会向您敞开 使用Gateway技术 您可以进入到几乎是无数种的表达系统 因为没有一个单一的表达系统适合于每一种蛋白 优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白Invitrogen已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中 无论选择