DNAExtraction法医学.ppt

DNAExtractionDNA提取 中山医学院法医物证教研室吕德坚 DNA提取的原因 DNA的分型需要DNA的直接参与反应过程DNA位于细胞内 细胞内可能含有抑制反应的蛋白或其他细胞成份DNA和蛋白质结合在一起不同的反应需要应用不同的DNA没有杂质纯DNA可使反应达到最佳法医学生物检材常含有抑制酶 PCR反应的物质 DNA提取方法 不同的检材用不同的方法不同的检材量可能使用不同方法和检材的细胞类型有关可根据肉眼 检查 显微镜下以及预试验来决定DNA的提取方法DNA提取的主要方法有机法 酚 氯仿法 Chelex法FTA纸法硅珠法 磁珠法碱裂解法 DNAEXTRACTION ORGANICCHELEXFTAPAPEROTHERSNON ORGANIC 6MNaCl QUICK DIRTY 0 2MNaOH QIAamp DNA提取的基本一般过程 破膜 裂解细胞膜 核膜去圬剂 SDS 低渗破坏蛋白质PK 加热提纯DNA沉淀去除杂质吸附杂质 有机法 organicextraction 经典的DNA抽提法先用SDS破膜 PK消化蛋白质 释放DNA用酚一氯仿萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质 而保留DNA于水相溶液中再用无水乙醇脱水 使DNA沉淀出来其提取的DNA分子结构完整 纯度较高 可抽提样本量大的DNA酚 氯仿法几乎适用所有种类生物检材的DNA提取 是DNA提取的基本方法 全血有机法过程 溶血 抗凝全血 红细胞裂解液 离心 吸去上清 保留离心管的底部有白色白细胞沉淀 沉淀物中加入细胞核裂解液 10mmol LTris HClpH8 2 0 4mol LNaCl 2mmol LEDTA 混匀加入SDS 蛋白酶K 摇匀 37 孵育消化8小时以上 酚 氯仿法提取加入与溶液等体积的Tris HCl饱和酚 轻摇 使酚和溶液混匀 摇晃太大力 可使DNA断裂 要有耐心 离心 离心管内的溶液分成两层 上层为含DNA的水相 下层为含有蛋白质的酚 将上层液体用吸管转移至另一个离心管内 注意不要触动分界面上积聚的变性蛋白 加入等体积的酚 氯仿 异丙醇混合物 酚 氯仿 异丙醇 25 24 1 混匀溶液 离心 离心管内的溶液分成两层 上层为含DNA的水相 将上层液体用吸管转移至另一个离心管内 加入等体积的氯仿 异丙醇混合物 氯仿 异丙醇 24 1 混匀溶液 将上层液体用吸管转移至另一个离心管内 加入2 3倍体积的冷100 乙醇 20 轻轻来回倒置摇匀 即见白色絮状的DNA析出 DNA可用火焰灭菌的玻璃钩针钩出 70 冷乙醇淋洗二次 室温干燥 干燥DNA的插入装有1 TE的Eppendorf管中 使DNA逐渐溶解从钩针上溶解下来 或者高速离心 使DNA沉淀下来 去掉液体 再用70 冷乙醇洗2次 以去除盐离子 室温干燥后 加入适量的1 TE或水溶解DNA 溶解DNA时最好是要过夜 因为过于干燥的DNA较难溶 提取的DNA在 20 可保存数年 酚 氯仿法中各种试剂主要作用 蛋白质分子表面带有亲水性基团 易通过水合作用进入水溶液中 酚的极性较低 氯仿是非极性分子 水是极性分子 酚或氯仿可以挤走蛋白质水溶液中的水分子 蛋白质失去水合作用而变性沉淀出来 酚或氯仿与水溶液的混合物离心后 由于比重的不同 酚 氯仿位于试管下层 有机相 水相位于上层 变性的蛋白质则聚集在两者的界面 DNA具有亲水性 仍保留在水相中 酚的变性作用很强 但与水有一定的互溶 这部水溶液中的DNA就会丢失 氯仿的变性作用不如酚 但与水不互溶 不会带走DNA 所以抽提过程中酚与氯仿混合使用 氯仿还有助于水相与有机相分离 氯仿与酚是互溶的 酚 氯抽提后 单独用氯仿再抽取一次 以去除残留的酚 否则酚对后面的反应有抑制作用 酚是酸性的 DNA可溶于酸性有机溶剂 因此 酚在使用前必须用0 5MTris HCl pH8 0 饱和 使其pH值在7 8以上 酚的饱和过程又叫做酚的平衡 经过饱和pH值在7 8以上的酚称为饱和酚或平衡酚 pH 8时 DNA更易进入水相中 并防止酸性酚溶解DNA 经饱和的酚常加入0 01 w v 8 羟基喹啉固体粉末 8 hydroxyquinoline 此时的饱和酚为淡黄色 这种酚可以在4 保存一段时间 之后淡黄色消失或呈粉红色 说明酚已被氧化 不能再使用 8 羟基喹啉不仅具有抗氧化作用 而且是一种指示剂 8 羟基喹啉还是弱的金属离子螯合剂 有抑制RNase的作用 异戊醇的作用是降低分子的表面张力 减少混合过程中泡沫的发生 使有机相和水相充分作用 并使有机相 变性蛋白和水相易于分相 SDS的作用 SDS是一种去垢剂 它可以破坏细胞膜 解聚核蛋白 使蛋白质变性 EDTA ethylenediaminetetra aceticacid 乙二胺四乙酸 的作用 EDTA常用它的钠盐 TE等缓冲液中含有EDTA EDTA是一种螯合剂 可以螯合Ca2 Mg2 等离子 这些离子是核酸酶具有活性所必须的辅基 因此 EDTA可以抑制核酸酶对DNA的降解 乙醇的作用 乙醇主要用来沉淀DNA 乙醇可以与水相溶 通过脱水作用夺去DNA周围的水分子 使DNA分子发生聚合而沉淀出来 使用时一般加入DNA溶液2倍体积的无水乙醇 使其终浓度为67 左右 乙醇在使用前一般使用要在 20 中预冷 其目前是降低分子的运动 使DNA易于沉淀出来 沉淀出来的DNA要用70 的乙醇洗涤 其目的是洗去一些离子 以防止这些离子对以后实验的影响 蛋白酶K 蛋白酶K proteinaseK PK 的主要作用是降解蛋白质 PK的使用终浓度一般为100 g 20mg ml 酚 氯仿的缺点 1 有的生物学检材 包括血 软组织 精液 唾液 牙齿和骨等 以及各种附在物体上 如布类 地毯 墙壁 木材 信封和烟蒂等 的斑痕 在提取之前 这些检材已经受到各种环境因素的作用 如温度和湿度的变化 微生物和化学物质的污染 士壤及其他自然界物质接触 如盐 水 提取后的保存不当也会引起DNA的降解 这些常含有抑制PCR的物质 有机法在提取这些检材的DNA时常出现不能去除抑制物的情况 尽管可以提取到足够多的DNA 但扩增并不总是成功 2 为了去除有抑制物 用有机溶剂抽提之后 要用Centricon100或Microcon100进行透析和浓缩 因此有机法的DNA提取过程比较复杂 也比较耗时 3 步骤多 样本需要多次转移增加了污染的可能性 4 损失部分DNA 5 酚和氯仿等有机溶剂对人体有害 ORGANICDNAEXTRACTION PHENOL CHLOROFORM ISOAMYLALCOHOL PCI RFLPorPCRYIELDSHIGHMOLECULARWEIGHTDNA HMWDNA TIMECONSUMINGHAZARDOUSCHEMICALSMULTIPLETRANSFERS possibleerrors 盐析法 往DNA溶液中加入NaAc或NaCl 使溶液中的离子发生 DNA所带的电荷随之发生改变 DNA析出 离心可使之沉淀出来 Chelex法 Chelex是一种螯合离子交换树脂 1991年Walsh等人用Chelex100处理法医学检材 发现用它提取DNA非常适合于用PCR的扩增 从此成为法医学上最常用的DNA提取方法 Chelex100这种树脂由苯乙烯 二乙烯基苯共聚物组成 含有成对的亚氨基二乙酸盐离子 是多价金属离子的螯合基团 Chelex可以螯合铜 铁及其他重金属离子包括钠 钾等单价阳离子 对二个离子的亲和力特别强 CHELEXEXTRACTION 1991Bio RadLaboratoriesCHELATINGRESINREMOVESMAGNESIUM INACTIVATESDNANUCLEASES USEWITHPCRONLY 金属离子是PCR反应的抑制剂 Chelex100通过螯合金属离子清除PCR反应的抑制剂 起纯化的作用 Chelex100不会改变非金属离子的浓度 核酸酶具有活性必须有金属离子 在高温和低离子强度的条件下 金属离子是DNA断裂的催化剂 Chelex100通过螯合金属离子保护DNA 阻止DNA的降解 Chelex100具有碱性 在100 条件下 细胞膜被破坏 DNA发生变性而释放出来 Chelex100本身并没有提取DNA的能力 除了金属离子以外 Chelex100可能还结合了其他一些PCR抑制剂 如亚铁血红素或其衍生物 全血的Chelex100提取法 Chelex100ExtractionofWholeBlood 分离出白细胞 加入用无菌去离子H2O水制备的5 w v 的Chelex 100悬液200 l 振荡 重悬沉淀 在56 温育30min后 高速振荡5 10s 水浴中煮8min 或在PCR仪中99 10min 高速振荡5s 10000rpm离心10min 使树脂 细胞碎片和变性的蛋白质沉淀 取上清进行DNA定量和PCR扩增 Chelex100法优点 1 步骤少 简单 快速 省时 2 提取过程在一个管内完成 避免污染 减少操作上所致的失误 3 清除PCR抑制物 提高PCR的成功率 4 所需的检材量少 5 避免了如酚 氯仿等化学试剂所潜在的危险性 Chelex 100法的缺点 1 处理的检材量不能太多 只适用于提取少量的DNA 2 提取的DNA的纯度不及有机法 3 提取的是单链DNA 不能用来做RFLP分析 Chelex 100法的注意事项 1 Chelex100树脂颗粒会沉淀 使用前必须摇匀悬液 2 吸取Chelex100悬液的吸头的孔径要比较大 必要时可剪去一部分 以保证吸到的是5 悬液 3 Chelex100法的第一步首先要洗去可能有的污染物和抑制物 如亚铁血红素和其他蛋白 必要时可洗几次 组织和骨头则不需要洗涤这一步 4 Chelex100法不含有纯化的步骤 如果检材含有抑制物和污染物 增加检材的用量也会同时提高抑制物和污染物的浓度 要确定是否有扩增抑制物 可以取部分检材的提取液加入已知阳性对照的反应中 观察扩增是否受到抑制 5 如果血痕紧紧地吸附在基质上 第一步洗涤的时候应放在56 中 以助于血从基质上溶解下来 6 每批新的Chelex100都要进行测试 可用已知基因型的血痕或全血提取DNA 或者先用少量Chelex100悬液中加入1 10 w v 的已知DNA 然用最灵敏的方法进行PCR扩增和分型 如果有扩增产物 分型结果理想 说明该Chelex100没有抑制物 7 5 Chelex100悬液都应新鲜配制 Chelex100在水中几个小时后的螯合能力就会逐渐下降 8 Chelex100发挥作用应要有一定的pH值 5 Chelex100悬液的pH值应为10 0和11 0之间 若不在这个范围内也不要调整悬液的pH值 9 Chelex100提取所得的是单链DNA 不适宜用插入染色剂 如溴乙锭 的方法来定量 建议用缝隙印迹 slot blot 杂交法定量 10 Chelex100提取液如果短时间内 1个月 保存 可贮存在4 若要长期保存 离心后弃去Chelex100树脂 取上清液冻存于 20 Chelex100树脂在过了一段时间后会变质降解 原来结合在树脂上的抑制物就会释放出来 树脂本身也会螯合镁离子而抑制PCR 11 由于Chelex100能螯合镁离子 所以PCR反应体系中不能有Chelex100树脂 必须充分离心去除 FTApapermethod 将血液滴于FTA卡上 或将口腔拭子涂于FTA卡上 晾干 用打孔器取一小块有标本的FTA卡放一PCR管中 用FTA卡缓冲液洗两次用纯水洗两次 干燥直接往PCR管中加入PCR反应试剂作PCR扩增 操作简便FTA卡可灭菌 可保存几十年 FTA PAPEREXTRACTION CELLULOSE BASEDSTORAGEPAPERCONTAINSCHEMICALSTOPREVENTNUCLEASEACTIVITYANDINHIBITBACTERIALGROWTHSTABLEATROOMTEMPFORYEARSUSEFORBLOODORSALIVASAMPLESFROMVICTIMSORSUSPECTS FTA PAPEREXTRACTION DrybloodorsalivaontoFTApaperCellsareLYSEDoncontactUSE PUNCH toaddSAMPLEtoTUBEWASHtoremoveHEME OtherPCRInhibitorsAdd PUNCH DIRECTLYtoPCRreaction FTA PAPEREXTRACTION NOQUANTITATIONneededConsistentamountofsampleConsistentresultsAUTOMATIONpossible Punch maybeRE USEDforothertests 硅 磁 珠粒吸附法 原理 在一定条件下 如高浓度的硫氰酸胍 DNA能够被二氧化硅或磁珠特异性地吸附 不溶的物质不被吸附而被去除 吸附后漂洗 将溶解的 抑制剂洗去 当改变条件后 用洗脱液 DNA又可以从二氧化硅上解离出来 硅 磁 珠粒吸附法 碱裂解法 碱性裂解法是指在强碱作用下 使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸 天冬氨酸 半胱氨酸 酪氨酸残基等迅速发生电离 从而快速破坏蛋白质的一级结构 正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用 所以 检材在强碱性 条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞及核膜 使核酸酶变性及 释放 而此时 的一级结构是相对完整的 先用强碱 NaOH 破坏细胞结构再用中和液中和 使溶液维持在中性或偏碱性离心 上清可作PCR 差异消化提取法DifferentialExtraction 又称二步消化法用于精子和其它细胞的混合物检验 如强奸案的阴道拭子精子的细胞膜含有巯基构成二硫键 可抵抗SDS和PK的消化作用DTT可水解二硫键 DIFFERENTIALEXTRACTION SEXUALASSAULTCASESMIXTURESPERMCELLSOTHERCELLSVAGINALEPITHELIALCELLSWHITEBLOODCELLSMALEEPITHELIALCELLS DIFFERENTIALEXTRACTION RUPTURENON SPERMCELLSSDSPROTEINASEKPELLETSPERMCELLSREMOVEDNASUPERNATANTRUPTURESPERMCELLSSDSPROTEINASEKDTT DIFFERENTIALEXTRACTION DTTBREAKSDISULFIDEBONDSINSPERMMEMBRANEWILLNOTWORKFORVASECTOMIZEDORAZOOSPERMICMALESEPITHELIALFRACTIONWILLSHOWMIXYCHROMOSOMESPECIFICMARKERSCANBEUSED 实验的基本步骤 阴道拭子一步 先用SDS和PK消化上皮细胞 释放出上皮细胞的DNA 去除上皮细胞的DNA二步 再用DTT SDS和PK消化精子 得到精子的DNA常分离不彻底一步会消化一部分精子的DNA DNA的浓缩和纯化 乙醇沉淀法凝胶切割法低熔点琼脂糖法超滤法Centricon 100法Microcom 100法 低熔点琼脂糖法 Centricon 100法 Centricon浓缩器内有一层各向异性的膜 通过超滤作用可以对大分子溶液进行浓缩和脱盐 Centricon必须用有固定角度的转头离心 膜与离心力的方向有一个角度 在样品的浓缩过程中 样品溶液收集在有样品一面膜的边缘 整个过程的滤过率高而一致 如果用水平转子离心 样品在整个膜上面覆盖 会明显降低溶液的滤过 当溶液到达膜的边缘后 过滤作用停止 因此 转角的大小与最后所得的溶液体积有关 Centricon浓缩器的组成 Centricon离心过滤器的使用 1 将样品管插入到滤液管上 2 加入DNA样品液到样品管 最大2mL 3 将盖好的浓缩器放入离心机中 4 以1000 g对CentriconYM 100进行离心 5 将离心过滤浓缩器从离心机上取下 然后从膜支撑基底上取下滤液管 按需要丢弃或保留滤液管 6 将滞留管接在样品管管上 倒转过来 在离心机中以300 1000 g离心2min 将浓缩的样品转移入滞留管中 7 从离心机上取下浓缩过滤器 取下滞留管 用盖盖住滞留管或滤液管 或者用滞留管盖滤液管以滞留管和滤液器可以一起存放 Microcon 100法 Microcon离心过滤器可以对10 500 L的大分子溶液进行脱盐和浓缩Microcon 100需要一个可以使用1 5mL微离心管 转头角固定的可变速离心机 每个Microcon100离心过滤器含有两个带盖的管子 一个用收集滤液 一个用来回收滞留的样品 Microcon 100的组成 Microcon离心过滤器的使用 1 将Microcon样品管插入滤液管中 2 将样品溶液加入到样品管中 最大0 5ml 封盖 3 把装好Microcon放入离心机中 盖子上的带指向转子的中央 4 用适当的转速和时间进行离心 5 从离心机上取下Microcon 分离滤液管和样品管 6 将样品管的上端倒转向下插入一新的滞留液收集管中 1000 g离心3min 转移浓缩的滞留液至收集管中 7 从离心机上取下Microcon 分离样品管 将滤液和滞留液的管盖盖紧 保存产物 DNA定量 凝胶产量法UV计法杂交法实时PCR法 凝胶产量法 杂交法 探针具有人种属特异性不受细菌DNA影响灵度非常高 DNAQUANTIFICATION ESSENTIALFORPCRTESTINGTOOLITTLECAUSESALLELEDROPOUTORSTOCHASTICFLUCTUATIONTOOMUCHCAUSESOFFSCALEDATAEARLYMETHODSNOTVERYSENSITIVEORSPECIFICABSORBANCEAT260nmETHIDIUMBROMIDE DNAQUANTIFICATION SLOTBLOTQUANTIFICATIONSPECIFICFORHUMANORPRIMATEDNAD17Z1RADIOACTIVECOLORIMETRICCHEMILUMINESCENT DNAQUANTIFICATION CAPTUREGENOMICDNAONNYLONMEMBRANEADDD17Z1PROBEINTENSITYOFSAMPLECOMPAREDTOSTANDARDSSENSITIVETO 150pgDNAor50copiesofgenomicDNA DNAQUANTIFICATION PICOGREENMICROTITERPLATEASSAYUSEDFORHIGHTHROUGHPUTMETHODS96WELLPLATESAUTOMATEDPROCEDURESENSITIVETO 250pgDNA80SAMPLESANALYZEDIN30MINUTESNOTHUMANSPECIFIC BACTERIACONTAMINATION DNAQUANTIFICATION PCRAMPLIFICATIONPICKY0 5TO1 0ngDNA1ngDNAroughlyequals333copies 167CELLSEACHDIPLOIDCELLhasroughly6pgDNAEACHHAPLOIDCELLhasroughly3pgDNA QuantiBlotHumanDNAQuantitationKit SlotBloting AluQuant AluQuant 采用二步温育定量人类DNA 第一步温育时发生焦磷酸化反应