标准操作程序 动物源性食品中硝基呋喃类药物残留量测定方法

标准操作程序 Standard Operation Procedure 动物源性食品中硝基呋喃类药物残留量测定方法 液相色谱 串联质谱检测法 Method for Determination of Nitrofurans Residues in Animal Producing Food LC MS MS Method 实施日期2006 07 11验证日期2006 7 4 Times new roman 小二号 居中 2 动物源性食品中动物源性食品中硝基呋喃类药物硝基呋喃类药物残留量测定方法残留量测定方法 液湘色谱液湘色谱 串联质谱检测法串联质谱检测法 标准操作程序标准操作程序 1 1 安全提示安全提示 本标准操作程序中用到易燃有毒化学品 例如甲醇 乙腈 应避免吸入其蒸气或直 接与皮肤接触 处理此类物质时可在通风橱内操作 必要时可佩带防护手套 防护镜或 防毒面具 2 2 方法提要方法提要 本标准操作程序是本实验室参照 FIC B074 2004 动物源性食品中硝基呋喃类药物残 留量的测定方法 进行周密验证后 将某些关键步骤进行细化而制定的 本方法适用于水产品 动物肝脏中的硝基呋喃残留量的检测 3 原理原理 样品经0 2M HCl提取 样品中的AOZ SEM AHD AMOZ残留物与衍生化试剂2 硝基苯 甲醛 NBA 反应 分别生成NP AOZ NP SEM NP AHD NP AMOZ 衍生物经乙酸乙酯萃 取 萃取液用氮气流挥干 残渣用乙腈 乙酸混合物溶解后用正己烷脱脂 用液相色谱 质谱 质谱仪测定 内标法峰面积定量 4 4 测定低限 线性范围 回收率范围和精密度测定低限 线性范围 回收率范围和精密度 本方法测定低限为 0 50 g kg 样品添加回收率及精密度测试结果 n 6 分别见表1 表2 表3 本方法线性范围为 0 5 g L 相当于样品的0 2 5 g kg 3 表1 鱼肉样品添加回收率及精密度测试结果 n 6 表 2 烤鳗样品添加回收率及精密度测试结果 n 6 0 50 g kg0 75 g kg1 0 g kg 回收率 回收率 回收率 添加 水平 组分 平均最高最低 CV 平均最高最低 CV 平均最高最低 CV AOZ 116 7120 4114 6 2 0106 3 115 789 9 11 2105 8 117 098 9 6 1 AMOZ 83 084 280 6 1 783 0 89 177 1 6 883 9 88 777 8 5 7 SEM 97 6103 094 0 3 9100 4 117 691 3 9 895 1 100 089 2 5 6 AHD 122 3133 4106 8 8 8101 9 113 189 5 9 892 9 104 075 7 14 8 表3 虾样品添加回收率及精密度测试结果 n 6 5 仪器和设备仪器和设备 5 1 配备 Agilent 液相色谱仪 四元低压梯度输液泵 自动进样器 柱温箱 电喷雾离 子源 Valco 二位流路切换阀 AB 公司 Analyst 仪器控制及数据处理软件 5 2 匀浆机 配备直径 19 mm 匀浆刀 德国 IKA 5 3 低温高速离心机 5000 r min Sigma 4K15 5 4 肉类组织粉碎机 PHILIPS 5 5 吹氮浓缩装置 Zymark Turbovap LV 5 6 漩涡振荡器 德国 IKA 5 7 可控温摇床 HZQ Q 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 5 8 离心管 具塞 50 mL 5 9 滤膜 0 2 m 有机相过滤用 津腾 尼龙6 0 50 g kg0 75 g kg1 0 g kg 回收率 回收率 回收率 添加 水平 组分 平均最高最低 CV 平均最高最低 CV 平均最高最低 CV AOZ 114 8120 4105 6 6 3107 5 132 392 7 13 6100 1 108 093 5 5 6 AMOZ 88 299 646 8 8 688 0 99 570 9 12 080 9 86 874 8 6 0 SEM 99 7107 488 6 6 799 0 107 183 1 8 496 6 111 087 4 9 6 AHD 152 4222 098 4 31 794 1 120 474 8 21 8115 5 159 072 2 25 1 0 50 g kg0 75 g kg1 0 g kg 回收率 回收率 回收率 添加 水平 组分 平均最高最低 CV 平均最高最低 CV 平均最高最低 CV AOZ 115 6125 8111 0 4 5113 9 156 089 3 21 198 3 105 090 9 6 0 AMOZ 85 188 677 6 6 684 8 92 378 0 6 982 0 88 975 5 6 2 SEM 99 8110 681 6 9 896 2 119 274 0 18 796 5 112 088 7 8 7 AHD 108 2127 498 4 10 4104 1 119 585 2 14 4112 2 129 0101 0 8 7 4 6 6 试剂和溶液试剂和溶液 本实验所用水为超纯水 6 1 试剂 6 1 1 乙腈 甲醇 乙酸乙酯 正己烷均为色谱纯 6 1 2 2 硝基苯甲醛 NBA 分析纯 Fluka 6 1 3 50mMol L NBA 溶液 称取37 8 0 5 mg 2 硝基苯甲醛至棕色瓶中 加入5 mL二甲亚砜溶解 使用前配制 6 1 4 盐酸 分析纯 6 1 5 氢氧化钾 分析纯 6 1 6 磷酸氢二钾 分析纯 6 2 溶液 6 2 1 0 125 Mol L盐酸溶液 6 2 2 1Mol L 氢氧化钾溶液 6 2 3 0 1Mol L 磷酸氢二钾溶液 6 2 4 样品定容液 乙腈 0 1 乙酸 1 9 6 3 标准物质和标准溶液 6 3 1 代谢物 AOZ SEM AHD AMOZ 标准品 纯度 98 内标 AMOZ D5 AOZ D4 AHD D2 SEM 13C15N2纯度 95 SIGMA 硝基呋喃类药物的结构式 呋喃唑酮代谢物结构图 呋喃它酮代谢物结构图 呋喃妥因代谢物结构图 呋喃西林代谢物结构图 2 6 3 2 AOZ SEM AHD AMOZ 标准储备液 分别称取AOZ SEM AHD AMOZ标准品各20 0 mg于不同的100 0 mL棕色容量瓶中 用甲醇溶解并稀释至刻度 此溶液1mL分别相当于200 g的AOZ SEM AHD AMOZ 该储 备液置于 20 冰箱中保存 保存期一年 6 3 3 AOZ SEM AHD AMOZ 标准混合液 1 g mL 分别准确吸取1 0 mLAOZ SEM AHD AMOZ标准储备液 6 3 2 于200 0 mL棕色容 量瓶中 用甲醇定容至刻度 此溶液1 mL分别相当于1 g的AOZ SEM AHD AMOZ 该 混合液置于 20 冰箱中保存 保存期9个月 6 3 4 AOZ SEM AHD AMOZ 标准混合工作液 20ng mL 准确吸取1 0 mL浓度为1 g mL的AOZ SEM AHD AMOZ标准混合液 6 3 3 于50 0 mL棕色容量瓶中 用甲醇定容至刻度 此溶液1 mL分别相当于20 ng的 AOZ SEM AHD AMOZ 该标准混合工作液即配即用 6 3 5 内标储备液 分别称取AMOZ D5 AOZ D4 AHD D2 SEM 13C15N2标准品各20 0 mg于不同的200 0 mL 棕色容量瓶中 用甲醇溶解并稀释至刻度 此溶液1 mL分别相当于100 g的AMOZ D5 AOZ D4 AHD D2 SEM 13C15N2 该储备液置于 20 冰箱中保存 保存期一年 6 3 6 内标混合液 1 g mL 分别准确吸取1 0 mL AMOZ D5 AOZ D4 AHD D2 SEM 13C15N2内标储备液 6 3 5 于100 0mL棕色容量瓶中 用甲醇定容至刻度 此溶液1 mL分别相当于1 g的AMOZ D5 AOZ D4 AHD D2 SEM 13C15N2 该混合液置于 20 冰箱中保存 保存期9个月 6 3 7 内标混合工作液 20ng mL 准确吸取60 L 浓度为1 g mL的内标混合液 6 3 6 于液相色谱进样瓶中 准 确加入2940 L甲醇 此溶液1 mL分别相当于20 ng的AMOZ D5 AOZ D4 AHD D2 SEM 13C15N2 该内标混合工作液即配即用 7 7 实验方法实验方法 7 1 试样制备 送实验室待测样品 用组织粉碎机捣碎 均分成两份 装入洁净容器内 作为试样 密封 并标明标记 于 18 保存 每份样品量应大于100g 7 2 分析步骤 7 2 1 提取步骤 3 称取经肉类组织粉碎机粉碎的试样2g 精确至0 01g 于50mL离心管中 加入150 L 内标混合工作液 6 3 7 10mL 0 125 Mol L盐酸溶液在匀浆机上以14000r min速度匀 浆30秒 用5mL 0 125 Mol L盐酸溶液洗涤匀浆刀 合并提取液 7 2 2 衍生化 离心管中加入200 L新鲜配制的2 硝基苯甲醛 NBA 衍生试剂 6 1 3 漩涡振 荡器上混漩30秒 放在37 摇床中反应14 16小时 放置过夜 反应完毕后取出离心 管冷却至室温 衍生化过程要注意避光操作 7 2 3 净化方法 离心管在4000 r min下离心10 min 上清液转入另一离心管中 残渣弃去 上清液 中加入5 mL 0 1 Mol L K2HPO4溶液 16滴 0 6 mL 1 Mol L KOH溶液 摇匀 调节pH值 在7 7 5范围 30秒后重复测定一次pH值 如pH值有变动 重新调节pH值 离心管中加 入10mL乙酸乙酯 振摇2 min 以4000 r min速度离心5 min 上层清液移至吹氮浓缩仪 的吹氮管中 重复乙酸乙酯5mL抽提步骤一次 离心后的上清液合并至吹氮浓缩仪的30 mL试管中 在50 下用氮气将试管内的溶剂挥干 残渣用0 70 mL乙腈 0 1 乙酸水溶液 1 9 v v 溶解 漩涡振荡器上混漩30秒 加入3 mL正己烷 漩涡振荡器上混漩30秒 弃去上层正己烷溶液 加入3 mL正己烷重复脱脂 下层样品溶液在12000 r min下离心10 min后经0 2 m滤膜过滤后上机测定 操作过程要注意避光 7 2 4 仪器参数与测定 7 2 4 1 色谱测定条件 a 色谱柱 NUCLEODUR 100 3 C18 ec 100 mm 2 0 mm id 粒度5 m MACHEREY NAGEL b 流动相 乙腈 0 1 乙酸水溶液 梯度洗脱模式 梯度表分别见表4 表5 表4 流动相梯度表 时间 min乙腈 0 1 乙酸 流速 mL min 0 0010900 20 7 0050500 20 9 0050500 20 9 0110900 20 25 0010900 20 4 表5 流动相梯度表 时间 min乙腈 0 1 乙酸 流速 mL min 0 0010900 25 4 0085150 25 6 5085150 25 6 6010900 25 14 0010900 25 c 柱温 35 d 进样量 20 l e 接口及离子化方式 ESI 正离子检测 雾化气NEB 8 mL min 气帘气CUR 10 mL min 辅助气7000 mL min 辅助气温度550 碰撞气CAD 7 mL min 四种气体均为氮气 电 离电压 5000V EP 10V 各离子对的去簇电压DP 碰撞能CE见表6 Q1为单位分辨率 Q3 为 低分辨率 7 2 4 2 质谱条件 见表6 表6 质谱参数 离子对 DP VFP V Time msec CE VCXP V 249 2 134 23501715 NP AHD 249 2 104 1 55 250 150 3515 内标 NP AHD D2 251 2 134 0552501501715 236 0 104 03017 NP AOZ 236 0 134 0 44260150 1821 内标 NP AOZ D4 240 0 134 0442601501821 209 0 166 01515 NP SEM 209 0 192 0 42250150 1715 内标 NP SEM 13C15N2 212 0 195 0422501501715 335 0 262 01025 NP AMOZ 335 0 291 0 42250150 1815 内标 NP AMOZ D5 340 0 296 0422501501815 5 7 2 5 仪器测定 7 2 5 1 检测方式 多反应选择离子监测方式 MRM 各监测离子如表7 表 7 硝基呋喃代谢物监测离子 检测物质保留时间 min 梯度1 梯度2 定量用子离子定量用内标 NP AOZ10 78 3236 0 134 0NP AOZ D4 NP SEM9 87 6209 0 166 0NP SEM 13C15N2 NP AHD9 97 7249 2 134 0NP AHD D2 NP AMOZ6 15 00335 0 291 0NP AMOZ D5 注 梯度 1 采用表 4 的参数 梯度 2 采用表 5 的参数 7 2 5 2标准曲线 按表8分别准确吸取一定量的浓度为20 ng mL AOZ SEM AHD AMOZ标准混合工作液 至50 mL离心管中 加入150 L内标混合工作液 15 mL0 125 Mol L盐酸溶液 摇匀 按 7 2 2 7 2 3步骤处理 样品净化时加入5 mL 0 1 Mol L K2HPO4溶液 1 6 mL 1 Mol L KOH溶液 其余同7 2 3 表8 标准溶液配制 标准曲线溶液浓度 ng mL标准混合工作液 L 00 0 525 150 2100 5250 7 2 6 定性标准 7 2 6 1 保留时间 在相同试验条件下 样品中待检测物质与同时检测的标准品具有相同的保留时间 偏差在 2 5 之内 7 2 6 2 信噪比 定性分析所用特征离子其信噪比应达到 3 7 2 6 3 特征离子相对强度 6 样品中待确证的残留物的全部特征离子的相对强度应与同时检测的标准品一致 误 差在 20 之内 7 2 7 定量方法 内标法 峰面积定量 8 结果计算结果计算 8 1 内标法峰面积定量 以标准溶液分析物峰面积与标准溶液内标物峰面积的比值对标准溶液分析物绝对量 ng 与标准溶液内标物绝对量 ng 的比值作线性回归曲线 并得到线性回归方程 将样液中分析物峰面积与样液中内标物峰面积的比值和样液中内标绝对量 ng 代入线 性回归方程得到样液中分析物绝对量 ng 按下式计算样品中分析物含量 计算公式 m A X 式中 X 试样中目标化合物的含量 ng g A 从工作曲线上计算得样液中待测物绝对量 ng m 最终样液的质量 g 9 9检测质量控制标准检测质量控制标准 9 1 回收率范围 动物组织样品中AOZ SEM AHD AMOZ在测定浓度为0 50 2 0 g kg时 回收率范 围应为50 120 9 2 精密度范围 添加浓度为0 50 g kg时 变异系数允许范围在 23 9 3 相关系数 工作曲线的相关系数的最低值为0 99 10 分析步骤的关键控制点及说明分析步骤的关键控制点及说明 10 1 50 mMol L NBA 溶液要注意现用现配 7 10 2 衍生化过程要注意避光操作及净化操作过程要注意避免强光照射 10 3 用乙酸乙酯抽提步骤要振摇2 min以