色谱分离技术-离子疏水.ppt

第七章吸附分离技术 1 吸附分离的分类与原理 2 吸附分离的影响因素和操作模式 3 吸附分离的基本理论 4 吸附分离的应用 1 吸附分离的分类与原理 吸附 Adsorption 是指溶质从液相或气相转移到固相的现象 固相 吸附剂 Adsorbent 一般为多孔颗粒 按吸附作用力的不同将吸附分为三个类型 物理吸附 依靠吸附剂表面与溶质间的范德华力化学吸附 吸附剂表面活性点与溶质间发生化学结合 产生电子转移现象功能基吸附 通过吸附剂表面固定化的功能基团吸附目标溶质 物理吸附 吸附剂 主要指以物理吸附为主的固体吸附材料 吸附原理 主要依靠吸附剂与待分离物质间的分子间引力 即范德华力 特点 1 选择性差 2 吸附和解吸速度快吸附本质 U范德华 U定向 U诱导 U色散定向力 由于极性分子的永久偶极矩产生的分子间的静电引力 诱导力 极性分子与非极性分子之间的吸引力 极性分子产生的电场会诱导非极性分子极化 产生诱导偶极矩 色散力 指非极性分子间的引力 吸附剂类型 功能基吸附 离子交换吸附剂 静电作用疏水吸附剂 疏水作用亲和吸附剂 亲和作用 离子交换吸附 原理 吸附剂表面由极性分子或离子组成 能够吸附溶液中带相反电荷的离子形成双电层 同时在吸附剂与溶液间发生离子交换 即吸附剂吸附离子后 同时要放出相应摩尔数的离子于溶液中 溶质的电荷是交换吸附的决定因素 所带电荷越多 在吸附剂表面相反电荷点上的吸附力越强 离子交换法 是利用带电的被分离物质与离子交换填料上的离子交换能力的不同而进行分离的方法 离子交换树脂离子交换剂离子交换层析材料离子交换剂的组成 三部分惰性的不溶性的高分子固定骨架 也称载体 与载体以共价键连接的不能移动的活性基团 也称功能基团 与功能基团以离子键连接的可移动的活性离子 也称平衡离子 离子交换剂的载体及其特点 1 离子交换树脂载体 苯乙烯 二乙烯苯型最常用丙烯酸 二乙烯基苯酚醛树脂多乙烯多胺 环氧氯丙烷树脂特点 1 强度好 流速较高 2 较高的离子交换当量 3 耐强酸 强碱 4 抗污染能力强 适用范围 1 中小生物物质的纯化 氨基酸 抗生素 部分中药有效成分等 2 除盐 除重金属离子 如去离子水 去色素等 缺点 由于离子交换树脂疏水性强 交联度高 孔隙小 电荷密度高 容易导致蛋白质和酶的失活 不适于生物大分子的分离 国产离子交换树脂的骨架代号及分类代号 国产离子交换树脂的命名原则 D 交联度数字顺序号联接符号骨架代号顺序号分类代号骨架代号大孔型代号分类代号1 100为强酸性阳离子交换树脂101 200为弱酸性阳离子交换树脂201 300为强碱性阴离子交换树脂301 400为弱碱性阴离子交换树脂如 001 7是凝胶型苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂 交联度7 D201是大孔型苯乙烯系季胺I型强碱性阴离子交换树脂 2 离子交换层析材料载体 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 纤维素和亲水性聚乙烯等 特点 1 大分子能自由在骨架之间自由扩散和交换 亲水性强 表面积大 易吸附大分子 2 交换基团稀疏 对大分子的实际交换容量大 3 吸附力弱 交换和洗脱条件缓和 不易引起变性 4 分辨力强 能分离复杂的生物大分子混合物 应用 用于分离蛋白质 酶等大分子的生物活性物质 缺点 1 强度较差 流速低 2 强酸 强碱容易破坏天然多糖的结构 3 易污染 易被微生物降解 强阳阳离子交换剂弱阳离子交换剂强阴阴离子交换剂弱阴 离子交换剂的类型 阳离子交换剂 能与阳离子进行交换的离子交换剂 强阳 强酸性 离子交换剂活性基团是磺酸基团 SO3H 或次甲基磺酸基团 CH2 2SO3H 都是强酸性基团 其电离程度大且不受溶液pH的影响 当pH值在1 14范围内时 均能进行离子交换反应 中和 RSO3 H Na OH R SO3 Na H2O中性盐分解 RSO3 H Na ClR SO3 Na HCl复分解 R SO3 Na K Cl R SO3 K NaCl利用复分解原理 可将青霉素钾盐转成青霉素钠盐R SO3 Na Pen K R SO3 K Pen Na 弱阳 弱酸性 离子交换剂 活性基团是羧酸基团 COOH 氧 OCH2COOH 酚羟基团C6H5OH及 双酮基团 COCH2COCH3等 都是弱酸性基团 其电离程度受溶液pH的变化影响很大 在酸性溶液中几乎不发生交换反应 其交换能力随pH的下降而减少 随pH的升高而递增 羧酸阳离子交换树脂必须在pH 7的环境中才能正常工作 对于酸性更弱的酚羟基吸附剂 则应在pH 9的环境中才能正常反应 羧酸阳离子交换树脂在不同pH下的交换容量中和 RCOO H Na OH RCOO Na H2O复分解 RCOO Na K Cl RCOO K Na Cl 利用复分解原理提取链霉素R COO Na 3 Str 3H Cl R COO 3Str3H 3NaCl 阴离子交换剂 能与阴离子进行交换的离子交换剂强阴 强碱性 离子交换剂 活性基为季氨基团 有三甲胺基团RN CH3 3OH I型 和二甲基 羟基乙基胺基团 RN CH3 2 C2H4OH OH II型 和强酸性离子交换相似 其活性基团电离程度较强 不受溶液pH变化的影响 在pH 1 14范围内均可使用 中和 R N CH3 3OH H Cl R N CH3 3Cl H2O中性盐分解 R N CH3 3OH Na Cl R N CH3 3Cl Na OH 复分解 R N CH3 3Cl Na2SO42 R N CH3 3 2SO42 2Na Cl 主要用于制备无盐水 除去SiO2 CO32 等弱酸根 及卡那霉素 巴龙霉素 新霉素等的精制 弱阴 弱碱性 离子交换剂 活性基有伯胺基团 NH2 仲胺 NHR和叔胺 N R 2以及吡啶C6H5N等基团 如二乙氨乙基 CH2 2N H C2H5 2 DEAE 就是在分离蛋白上常用的弱阴离子交换基团 基团的电离程度弱 和弱酸阳离子树脂一样交换能力受pH的变化影响很大 pH越低 交换能力越高 故在pH 7的溶液中使用 中和 RN H3OH HClRN H3Cl H2O复分解 R N H3Cl 2 Na2 SO42 R N H3 2SO42 2NaCl 离子交换剂的性能评价 1 交换容量 是指单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数 是表征离子交换能力的主要因素 测定方法 对于阳离子交换剂 先用盐酸将其处理成氢型后 称重并测其含水量 同时称数克离子交换剂 加入过量已知浓度的NaOH 静止24小时或数日 测定剩余的NaOH摩尔数 就可求得该阳离子交换剂的交换容量 滴定曲线 其它性能 孔径 孔径分布 比表面积和孔隙率的表征吸附常数 吸附动力学 吸附等温线 假设只考虑溶质在表面的吸附 而忽略溶剂在表面的吸附作用 则在恒定温度下 吸附量只和溶质的浓度有关 b 单分子层吸附 c 多分子层吸附 不同溶质对吸附剂亲和力大小的评价 在这种情况下 A组分比B组分的亲和力低 它将首先从柱中脱附下来 Langmuir等温线 也被称为单分子层吸附等温线 假设 吸附在吸附剂的活性中心上进行吸附物分子间无相互作用每一个活性中心只能吸附一个分子但在实际的吸附中 特别是在蛋白质的吸附中 上述假设很难成立 在这种情况下 吸附方程可用如下方程描述 A 未被吸附的溶质分子S 吸附剂表面未被占有的活性位点AS 占据活性点的吸附剂分子Kad 平衡热力学常数理想条件下 Langmuir提出了表面占据分率的概念 假如A占据了吸附剂表面上的所有活性位点 则将上述两式结合 则得到Langmuir等温方程 影响离子交换分离的因素 离子交换的选择性用交换常数表示 1 水合离子半径的影响对无机离子而言 离子水合半径越小 离子对树脂活性基的亲合力越大 也就容易被吸附 按水化半径次序 各种离子对树脂亲合力大小的次序为 对一价阳离子 Li Na K NH4 Rb Cs Ag Pb2 对二价阳离子 Mg2 Zn2 Cu2 Ni2 Co2 Ca2 Sr2 Pb2 Ba2 对一价阴离子 F HCO3 Cl HSO3 Br NO3 I ClO4 如果是强酸或强碱树脂 H 和OH 的序位与Li 相当或在F 之前 而对弱酸或弱碱树脂 其交换序列在同价离子之后 2 离子化合价若交换离子的价电数大于平衡离子时 若溶液较稀 有利于离子的交换 交换离子的吸附量将增大 当有钠离子存在时 溶液的稀释对苯氧乙酸 酚 甲醛树脂吸附链霉素的影响 树脂对链霉素的交换容量为3 17meq g 可见 在较稀的溶液中 树脂几乎仅吸附高价离子 3 溶液的pH值由于溶液的pH值直接决定树脂交换基团及交换离子的解离程度 进而影响树脂对交换的选择性和吸附容量 对于强酸 强碱性树脂 溶液pH主要左右交换离子的解离度 决定它带何种电荷以及电荷量 决定被树脂吸附或吸附的强弱 对于弱酸 弱碱性树脂 溶液的pH还是影响树脂解离程度和吸附能力的重要因素 但过强的交换能力有时会影响到交换的选择性 同时增加洗脱难度 对生物活性分子而言 过强的吸附以及剧烈的洗脱条件会增加变性失活的机会 另外 树脂的解离程度与活性基团的水合程度也有密切关系 水合度高的溶涨度大 选择吸附能力下降 这就是为什么在分离蛋白质或酶时较少选用强酸 强碱树脂的原因 4 离子强度高的离子浓度必与目的物离子进行竞争 减少有效交换容量 另一方面 离子的存在会增加蛋白质分子以及树脂活性基团的水合作用 降低吸附选择性和交换速度 所以一般在保证目的蛋白质的溶解度和溶液缓冲能力的前提下 尽可能采用低离子强度 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示 I 流动相的离子强度 A和B为常数 为离子强度无限大时溶质的分配系数 是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配 对于蛋白质等两性电解质 在物理意义上 B为溶质的静电荷数与离子价数之比 在pH偏离等电点的溶液中 蛋白质溶质的静电数常为两位数以上 故B值较大 即蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感 在同一离子强度下 不同蛋白质的分配系数相差非常大 几个数量级 对于蛋白质的离子交换层析分离常采用DEAE CM等较弱的离子交换吸附剂 5 有机溶剂的影响离子交换树脂在水和非水体系中的行为是不同的 有机溶剂的存在会使树脂收缩 也会使有机物的电离度降低 不利于分子量较大的有机物的吸附 利用这个特性 常在洗涤剂中加适当有机溶剂来洗脱难洗脱的有机物质 6 交联度 膨胀度 分子筛对凝胶型树脂来说 交联度大 结构紧密 膨胀度小 树脂筛分能力大 促使吸附量增加 其交换常数亦大 相反 交联度小 结构松弛 膨胀度大 吸附量减少 交换常数值亦减少子不受阻碍 对于交联度大的凝胶型树脂有机大分子与无机离子在树脂内扩散速度不等 利用这一原理将大分子和无机离子分开的方法称为分子筛法 在抗生素 如链霉索 庆大雷索 去甲基万古霉素生产中 利用高交联度的1 14树脂去除Ca2 Mg2 能达到降低灰分 减少抗生素的损失的目的 7 树脂与离子间的辅助力离子交换树脂与被吸附离子间的作用力除静电力外 还存在一种辅助力 这一辅助力存在于被交换离子是有机离子的情况下 通常 无机离子进行交换时的交换常数K多在1 10之间 而有机离子交换时 相对分子质量越大 交换常数越大 K值有时可高达102 103 这种现象单纯采用静电吸附力无法解释 实际上是由于存在着一些辅助力 四环素族抗生素分子中酰胺基 一CONH2 上的H和磺酸树脂的功能基 一SO3H 上的氧易形成氢键 所以K值明显增大 尿素是一种中性物质 因能形成氢键 所以尿素溶液很容易将青霉素从磺酸树脂上洗脱下来 除氢键外 亦存在着树脂与被交换离子间的范德华力 例如 骨架内含有脂肪烃 苯环和萘环的树脂 它对芳香族化合物的吸附能力依次相应增加 酚硝酸树脂对一价季胺盐类阳离子的亲和力随离子的水合半径的增加而增加 这种现象与天机离子交换情况相反 这是由于吸附大分子时起主导作用的是范德华力而不是静电力 另有一些研究表明 树脂吸附较大离子后 在被吸附离子间存在辅助力 树脂吸附的大离子愈多 辅助力愈大 离子交换吸附分离的操作方法 1 离子交换吸附剂的选择保证分离目标物和主要杂质对吸附剂的吸附力有足够的差异 目的物具有较强的碱性和酸性时 宜选用弱酸性弱碱性的吸附剂 有利于提高选择性 并便于洗脱 目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时 往往选用强碱 强酸树脂 如氨基酸的分离多用强酸树脂 以保证有足够的结合力 对于蛋白质类生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性层析材料 以减少生物大分子的变性 有利于洗脱 并提高选择性 小分子选用离子交换树脂 蛋白质等生物大分子选用离子交换层析材料 吸附条件 1 调整pH值使目标物与吸附剂离子交换功能基带相反电性 2 低的离子强度或低盐浓度上样洗脱条件调整pH值或增加离子强度 高盐浓度洗脱 离子交换 IEC 的应用及特点 IEC 是蛋白质 肽和核酸等生物产物的主要纯化手段IEC分离的特点 1 料液处理量大 具有浓缩作用 可在较高流速下操作 2 应用范围广泛 优化操作条件可大幅度提高分离的选择性 所需柱长较短 3 产品回收率高 4 商品化的离子交换剂种类多 选择余地大 价格也远低于亲合吸附剂 疏水作用层析 色谱 一 原理疏水作用层析 Hydrophobicinteractionchromatography HIC 是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相 根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法 二 疏水性吸附剂将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂 常用的疏水性配基 苯基 短链烷基 C3 C8 烷氨基 聚乙二醇和聚醚等 吸附特点 疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性 疏水链长度 和配基密度成正比 故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异 疏水性高的配基较疏水性低的配基修饰密度低 一般配基修饰密度在10 40 mol ml 配基修饰密度过小则疏水性吸附不足 密度过大则洗脱困难 三 HIC操作上样及洗脱的一般规律 在高盐浓度条件下 蛋白质与固定相疏水缔合 浓度降低时 疏水作用减弱 逐步被洗脱下来 一般用pH6 8的盐水溶液 如 NH4 2SO4 盐的浓度影响蛋白质的疏水性 从而影响蛋白质的保留值 盐 Na2SO4 KH2PO4 NaHPO4 NH4 2SO4 NH4OAc KOAc NaOAc NaCl盐析作用增强洗脱能力增强 1 影响疏水性吸附的因素蛋白质的疏水性与其荷电性质相比复杂得多 不易定量掌握 除疏水性吸附剂的性质 疏水性配基的结构和修饰密度 外 流动相的组成以及操作温度对蛋白质疏水性吸附的强弱均产生重要影响 1 离子强度及种类蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大 离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附 疏水性吸附与盐析沉淀一样 在高价阴离子的存在下作用力较高 因此HIC分离过程中主要利用硫酸铵 硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相 在略低于盐析点的盐浓度下进料 然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离 2 破坏水化作用的物质 和等离子半径较大 电荷密度低的阴离子可减弱水分子之间相互作用 这类阴离子与上述盐析作用强的高价阴离子 如 等 的作用正好相反 前者称为离液离子 chaotropicion 后者称为反离液离子 antichaotropicion 在离液离子存在下疏水性吸附减弱 蛋白质易于洗脱 除离液离子外 乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用 降低蛋白质的疏水性吸附作用 经常用做洗脱促进剂 洗脱疏水吸附强烈 仅靠降低盐浓度难于洗脱的高疏水性蛋白质 3 表面活性剂表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合 从而减弱蛋白质的疏水性吸附 根据这一原理 难溶于水的膜蛋白质可添加一定量的表面活性剂使其溶解 利用HIC法进行洗脱分离 但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜 浓度过小则膜蛋白不溶解 过大则抑制蛋白质的吸附 4 温度一般吸附为放热过程 温度越低吸附结合常数越大 但疏水性吸附与一般吸附相反 吸附结合作用随温度升高而增大 蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附 而失水是吸热过程 即疏水性吸附为吸热过程 0 因为 所以吸附平衡常数K随温度的升高而增大 2 蛋白质的分离蛋白质与HIC填料之间的作用很复杂 有时不能完全用疏水性相互作用来解释 有时配基苯环还会与蛋白质分子上的芳香族氨基酸产生 键 因此 在利用HIC分离蛋白质混合物时 需事先利用各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验 确定最佳吸附剂和洗脱剂 羟基磷灰石层析 羟基磷灰石 hydroxyapatite HAP 是一种磷酸钙晶体 基本分子结构为 一般认为 HAP的吸附主要基于钙高子和磷酸根离子的静电引力 即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面 各存在吸附点c点和P点 前者起阴离于交换作用 后者起阳离于交换作用 因此 在中性pH环境下酸性蛋白质 pI7 主要吸附于P点 利用磷酸盐缓冲液 K2HP04 KH2PO4 为流动相洗脱展开时 磷酸根离子在c点竞争性吸附 交换出酸性蛋白质 而K 在P点竞争性吸附 交换出碱性蛋白质 所以HAP层析通常以磷酸盐缓冲液为流动相 采用提高盐浓度的线性梯度洗脱法 应用 由于HAP晶体表面结构特别 吸附机理特殊 因此可用于识别DNA及RNA的单链和双链 分离IEC和HIC难于分离的蛋白质物系 例如 人肿瘤坏死因子 humantumournecrosisfactor hTNF 中构成蛋白质分子的差异很小 利用IEC法 高效RPC法和电泳法只能得到一个洗脱峰或电泳带 而利用HAP层析可分离得到4个洗脱峰 HAP吸附剂价格便宜 远低于高子交换剂 适用于大规模分离纯化过程 已成为单克降抗体的主要纯化手段 灌注层析 Perfusionchromatography 灌注层析 Perfusionchromatography 是美国PerSeptiveBiosystems公司于1989年开发的层析分离