PCR技术级硕士

PCR技术及应用,生物化学与分子生物学进展,中山大学中山医学院杨 霞,目 录,PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的类型和应用,PCR 可以在2小时内把 特定的基因指数放大,染色体,神奇而又简单的PCR,PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应,PCR技术的创建,一、最初的理论描述Khorana Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,二、PCR技术的发明Kary Mullis1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCRMullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,PCR技术的创建,PCR从构想成为现实 1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。,有关PCR反应,PCR反应体系PCR过程PCR的基本原理,有关PCR反应,PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理,有关PCR反应,94,55,37,?,三、PCR技术的改进和发展1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术，大大提高了PCR的效率。,Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,Saiki, 1988年,PCR技术的发展,72,94,55,PCR循环,三、PCR技术的改进和发展1988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。,Kary B. Mullis（1944）,,PCR仪的变迁,三个水浴锅，用手移动 （Mullis等人当时用的）电加热块 自来水冷却 （PE，1988）电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989）三个加热块 机械手 （Strategene，1994）半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf）空气加热 (Roche)梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪Lab-on-chip式的PCR仪(芯片PCR),全新4通道实时荧光定量PCR仪,普通PCR仪、梯度PCR仪,PCR技术的原理,无细胞分子克隆法：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,退 火,延 伸,经典循环参数（500bp以内）,94 30s 55 45s72 1min,94 5min,30次,72 7min,4 forever,PCR技术的特点,灵敏度高30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU细菌检测的最小检出率为3个细菌特异性强 引物序列与模板结合的特异性快速简便 一次性加好反应液，24小时即可完成扩增,1）不对称PCR2) 反向PCR3）多重PCR4）锚定PCR5）逆转录PCR6）原位PCR7) 荧光定量 PCR,PCR的类型,目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限 制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制 性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,不对称PCR,高浓度引物,低浓度引物,反向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,PCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列,对于未知序列怎么办？,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,原位PCR的作用,操作步骤1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2. PCR扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,荧光定量 PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。,荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor (Intergen),SYBR-Green I,SYBR-Green I,Taqman Probe,X,分子信标（Molecular Beacon Probe）,荧光定量PCR与普通PCR的比较实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便,无需跑胶,荧光定量PCR仪,普通PCR仪,PCR的应用领域,生物学基础研究 目的基因扩增和鉴定；DNA序列测定；定点突变；基因表达分析医学临床应用遗传疾病基因诊断；致病病原体检测；癌基因检测；器官移植组织配型法医学物证鉴定个体识别；亲子鉴定其他 动、植物检疫（转基因动植物检测）；生物物种鉴定，系统进化研究；分子考古学（恐龙DNA分析）等,分子克隆（目的基因的获取和鉴定）,PCR技术应用于科学研究,5,5,Bam H I,EcoR I,Bam H I,EcoR I,PCR(5端引入限制酶识别位点),PBS group,K5 group,*,Yang X（杨霞）, et al. Cancer Biology & Therapy(IF:3.3), 2006.,K5 通过抑制肿瘤血管新生抑制肝癌生长（RT-PCR技术获得K5基因）,PBS K5,PCR技术应用于科学研究,围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR缺失突变）,Yang X（杨霞）, et al. Journal of Cellular and Molecular Medicine(IF:5.2), 2009.,PCR技术应用于科学研究,临床基因诊断,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,PCR技术应用于临床检测,遗传疾病的基因诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,PCR技术应用于临床检测,A,正常人,病 人,正常,病人,A,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),PCR技术应用于临床检测,登革病毒的检测,登革病毒基因检测,1：Marker2：阳性模板3：待测样品14：已确诊乙肝病人样品5: 待测样品26: 待测样品37: 阳性模板,乙肝病毒基因检测,阴性,阴性,基因检测在乙肝诊疗各阶段的应用,药物治疗方案的确定（用药：干扰素、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦）,药物治疗（疗效评价）,前C区1896位点突变检测试剂盒,跟踪随访,乙 肝 病 毒 定 量 检 测 试 剂 盒,确诊,病毒学分析,乙肝病毒分型检测试剂盒,拉米夫定耐药检测试剂盒,阿德福韦耐药检测试剂盒,共价闭合环状DNA(cccDNA)检测试剂盒,恩替卡韦耐药检测试剂盒,PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分析),Ras癌基因,限制性内切酶,PCR技术应用于临床检测,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,法医学物证鉴定,个体识别；亲子鉴定方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性） DNA指纹 PCR-ASO （等位基因特异性寡核苷酸） PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性 PCR-STR（短串联重复序列）多态性 PCR-SSCP（单链构象多态性） 线粒体