湖南中医药大学牛振鹏本科毕业论文终稿

湖南中医药大学湖南中医药大学 2014 届本科生毕业论文届本科生毕业论文 题目 题目 糙叶五加叶有效成分的糙叶五加叶有效成分的 提取与分离提取与分离 姓姓名 名 牛振鹏牛振鹏 学学号 号 201004080134 专专业 业 中药资源与开发中药资源与开发 班班级 级 2010 级中药资源与开发班级中药资源与开发班 实习地点 实习地点 湖南中医药大学天然药化实验室湖南中医药大学天然药化实验室 指导老师 指导老师 刘向前刘向前教授教授 2014 年年 5 月月 10 日日 湖南中医药大学毕业设计 论文 指导教师评阅意见表湖南中医药大学毕业设计 论文 指导教师评阅意见表 论文题目糙叶五加叶有效成分的提取与分离 学生姓名牛振鹏学号201004080134学院药学院 指导教师姓名刘向前职称教授单位湖南中医药大学 论文评阅意见 指导教师 签名 年月日 湖南中医药大学湖南中医药大学毕业设计 论文 毕业设计 论文 成绩评审表成绩评审表 学号 学号 201004080134姓名姓名 牛振鹏牛振鹏专业班级 专业班级 2010 级级中药资源与开发班中药资源与开发班 论文题目 论文题目 糙叶五加叶有效成分的提取与分离糙叶五加叶有效成分的提取与分离 指标指标 项目项目 系数系数评评定定等等级级标标准准评评 定定 成成 绩绩 A 100 B 80 C 60 D 40 ABCD 论论文文内内容容 0 3 主题明确 重点突 出 内容充实 层 次分明 条理清 晰 能突出主题 重 点 内容较充实 层次尚分明 条 理性较好 能围绕主题 有重 点地论述 但内容 不够充实 条理性 一般 主题不明确 无重点 内容 空洞 杂乱无 章 论论点点论论据据 0 3 论点正确 说理充 分 结论正确 引 用文献资料恰当 论点基本正确 说理较充分 结 论可信 论点基本上正确 但说理不够充分 结论基本上可信 论 点 论 据 模 糊 结论难以 置信 论论文文书书写写 0 15 文句简练 通顺 格式符合要求 无 错别字 版面整洁 美观 文句较通顺 格 式基本上符合要 求 无错别字 版面较为整洁美 观 文句尚通顺 格式 基本上符合要求 有少量错别字 版 面不够整洁美观 文句不通顺 格式不符合要 求 错别字较 多版面凌乱 实实践践能能力力 0 15 能理论联系实际 具有较强的分析 和解决实际问题 能力 能 理 论 联 系 实 际 有一定的分 析 解决问题的 能力 能运用理论知识分 析 解决一般性问 题 利用理论知识 分析 解决问 题能力差 分分析析讨讨论论 0 1 熟悉本专题有关 的国内外研究动 态 并对该专题研 究有独到见解 认 识水平较高 了解与本专题有 关的研究动态 并有自己的认识 和见解 有一定 的水平 对与本专题有关的 研 究 动 态 不 太 了 解 但能阐述自己 的学术观点 对本专题的研 究动态了解得 很少 且认识 体会肤浅 得得 分分 说明 各学院可根据专业的特殊性做进一步的详细要求 湖南中医药大学湖南中医药大学毕业设计 论文 答辩表毕业设计 论文 答辩表 学生姓名牛振鹏学号201004080134年级专业2010 级中药资源与开发班 论文题目糙叶五加叶有效成分的提取与分离 答辩小组成员 签名 答辩记录 提问 1 2 3 答辩小组意见 得分组长签名日期 系 院 评审意见 综合成绩系 院 分管 领导签字 日期 I 糙叶五加叶有效成分的提取与分离 摘要 目的目的 研究糙叶五加叶的化学成分 方法方法 采用多种柱层析方法进行分离纯化 根据理化性质和现代破谱解析技术进 行结构鉴定 结果结果 从糙叶五加叶中分离得到3个化合物 分别鉴定为 豆甾醇 齐墩果酸 豆甾醇 3 O D 葡萄糖苷 结论结论 研究结果进一步明确了糙叶五加叶的物质基础 为今后开发该植物提供 了实验数据 对我国天然植物资源的开发利用以及中草药现代化研究具有一定的 参考价值 关键词关键词 糙叶五加叶 有效成分 结构鉴定 Extraction and Separation form the leaves of Acanthopanax henryi Oliv Harms active ingredients Abstract Objection To investigate the chemical constituents in the leaves of Acanthopanax henryi Oliv Harms active ingredients Methods The chemical constituents were isolated by silica gel their structures were identified by spectral analysis Results There compounds were isolated identified as Stigmasterol Oleanolic acid Stigmasterol 3 O D glucoside Conclusion The results clarify the material basis of antioxidant activety of the leaveas of Acanthopanax henryi Oliv Harms which provide reference for the future development of this plant It also has referred value on developing and exploitaging our country s natural products resource Key words Acanthopanax henryi active ingredients structure indentification II 目录 摘要 I Abstract I 目录 II 引言 1 1仪器与试剂 材料 2 1 1实验材料 2 1 2主要仪器设备 2 1 3主要化学试剂 3 2试验方法与结果 3 2 1药材提取 3 2 295 乙醇部位浸膏分离 3 2 2 1化合物 1 的分离 3 2 2 2化合物 2 的分离 4 2 2 3化合物 3 的分离 4 3结构鉴定 4 3 1化合物 1 结构鉴定 4 3 2化合物 2 结构鉴定 5 3 3化合物 3 结构鉴定 5 4结语 7 参考文献 8 致谢 10 1 引言 五加科 Araliaceae 五加属 Acanthopanax Miq 植物为直立或蔓生灌木 稀 为小乔木 1 该属植物具有较高的药用价值 现已收入 中国药典 的五加皮为 五加属植物细柱五加 A gracilistylus W W Smith 的干燥根皮 其性温 味辛 苦 归肝 肾经 具有补肝肾 祛风湿 通淤血 利水肿 强筋骨 镇痛解热等 功效 临床主要用于治疗小儿行迟 风湿痹痛 跌打骨折 腰膝软弱等病症 是 我们常用的重要中药材之一 2 而韩国药典以无梗五加 A sessiliflorus seem 为五 加皮正品 3 五加科 Araliaceae 五加属 Acanthopanax Miq 植物全世界已发现 的有37 种 主要分布于亚洲的中国 日本 韩国 在其他国家如印度 不丹 蒙古 尼泊尔 菲律宾 俄罗斯东北部 泰国 越南也有发现 我国有26 种18 变 种 占世界首位 广泛分布于南北各省 长江流域最多 此外韩国和日本也盛 产五加皮 4 五加属植物大都具有药用价值 目前已从五加属植物根部分离出多 种具有抗炎 抗癌细胞生长 防辐射 镇痛等药理活性的木脂素 二萜 三萜及 三萜皂苷类等化学成分 5 8 近年来 国内外学者还对五加属植物叶进行了大量 研究 韩国科学家从韩国特有的五加属植物韩五加Acanthopanax koreanum中分离 出具有显著抗炎 抗氧化 抗癌 促生长等作用的多种化合物 9 14 具有极大的 开发潜力 在医药界引起了广泛的关注 研究者们对细柱五加叶的药用价值做了 深入研究 从中分离出具有抗HMGB1活性 以及对局灶性脑梗塞大鼠有明显脑 保护作用和对D GalN LPS诱导的小鼠肝衰竭模型的保护作用的三萜类活性成分 15 19 为进一步开发利用五加属植物资源 开发我国具有自主知识产权的治疗肝 病 风湿病等疾病的先导化合物或药物提供了理论依据 糙叶五加 Acanthopanax henryi Oliv Harms 又名亨利五加 属于五加科五加 属植物 为中国特有植物 广泛分布于湖南 湖北 浙江 甘肃 四川 安徽等 地 其根皮作为 五加皮 收载于湖南省中药材地方标准 具有祛风湿 活血化 瘀 壮筋骨等功效 民间主要用于治疗风湿痹痛 拘挛麻木 筋骨痞软 水肿 跌打损伤 疝气腹痛等 20 作为湖南省的一种特产药用经济作物糙叶五加现已在 娄底和安化地区进行林产经济规范化种植 开展糙叶五加的研究有利于更好的开 发利用湖南的药用植物 为发展湖南中医药经济提供可靠理论依据 本课题对五 2 加属植物开展了系统研究 发现糙叶五加叶的提取物具有抗氧化和抗炎作用 已 从糙叶五加叶抗氧化活性部位中分离得到了新绿原酸 4 O 咖啡酰奎尼酸 异槲 皮苷 山柰酚 3 芸香糖苷 异绿原酸B 洋蓟素 异绿原酸A 异绿原酸C和槲 皮素 3 7 二葡萄糖苷等化合物 并对其中多个化合物进行了HPLC的定量研究 21 22 本论文仅对糙叶五加叶中部分有效成分提取 分离 鉴定的方法与结果作 如下阐述 1仪器与试剂 材料 1 1实验材料 药材于2012年10月采自湖南省娄底市新化县 经湖南中医药大学药学院刘向 前教授鉴定为糙叶五加Acanthopanax henryi Oliv Harms叶 自然干燥后备用 1 2主要仪器设备 表 1主要仪器设备一览表 仪器型号生产厂家 显微熔点测定仪SGWX 4 型上海精密科学仪器有限公司 傅里叶红外光谱仪AVATAR 360 型美国 Nicolet 公司 高分辨率质谱仪JMS 700 型日本电子株式会社 气质联用仪QP 2010 型日本岛津公司 二维核磁共振仪UNITY 500 型美国 Varian 公司 一维核磁共振仪INOVA 400 型美国 Varian 公司 旋转蒸发仪RV S 型巩义市予华仪器有限责任公司 循环水式真空泵SHZ D III 型巩义市予华仪器有限责任公司 电热恒温干燥箱202 004 型沪南电炉烘箱厂 中草药粉碎机FZ102天津市泰斯特仪器有限公司 高精密度电子天平AUW 120D日本岛津公司 真空干燥箱DZF 6020 型上海精密实验设备有限公司 三用紫外分析仪ZF7巩义市予华仪器有限责任公司 3 1 3主要化学试剂 表 2 主要化学试剂一览表 试剂名称规格生产厂家 薄层层析硅胶 G化学纯青岛海洋硅胶干燥剂厂 柱层析硅胶 G化学纯青岛海洋化工厂 硅胶 G 薄层板化学纯青海海洋化工厂 三氯甲烷化学纯天津恒兴化学试剂厂 甲醇化学纯天津恒兴化学试剂厂 乙醇化学纯天津恒兴化学试剂厂 羧甲基纤维素钠化学纯天津科密欧化学试剂开发中心 石油醚化学纯天津科密欧化学试剂开发中心 显色剂 10 H2SO4 EtOH自配 2试验方法与结果 2 1药材提取 将干燥的糙叶五加叶粉碎 称量 10 kg 用 100 kg 甲醇回流提取 浓缩得总浸 膏约 750 g 总浸膏用热水分散成悬浮状 用石油醚萃取 水层上 D101 大孔树 脂层析柱 乙醇 水梯度洗脱 水 30 50 75 95 乙醇 其中 95 乙醇 洗脱部分浸膏为6 5 g 经硅胶柱层析以CHCl3 MeOH 25 1 CHCl3 MeOH H2O 1 1 0 2 梯度洗脱 得到 12 个粗组分 2 295 乙醇部位浸膏分离 2 2 1化合物 1 的分离 将组分46 57 0 38 g 经硅胶柱层析 以氯仿 甲醇 60 1洗脱纯化 多 次重结晶 得到 46 mg白色针状结晶 4 2 2 2化合物 2 的分离 将组分 58 78 0 85 g 经硅胶柱层析 以氯仿 甲醇 40 1 洗脱纯化 多 次重结晶 得到 31 mg 白色针状结晶 2 2 3化合物 3 的分离 将组分 154 173 0 61 g 经硅胶柱层析 以氯仿 甲醇 10 1 洗脱纯化 多次重结晶 得到 84 mg 白色粉状结晶 3结构鉴定 3 1化合物 1 结构鉴定 白色针状结晶 石油醚 mp133 135 Liebermann Burchard 反应呈阳 性 判断该化合物为甾体或者三萜类化合物 IR cm 1 3421 OH 2960 CH3 2937 CH3 2867 CH 1642 CH 1642 C C 1465 CH2 1380 CH3 1060 C O 等处有较强吸收峰 核磁共振氢谱 1H NMR 600MHz CDCl3 谱 给出 6 个甲基信号 0 68 3H s H 18 1 01 3H s H 19 0 90 3H d J 6 6Hz H 29 0 93 6H d J 6 9Hz H 26 和 H 27 0 82 3H d J 6 8Hz H 21 三个烯氢质子信号 5 03 1H dd J 6 6Hz H 23 5 14 1H dd J 6 6Hz H 22 5 35 1H d H 6 以及一个羟基信号 3 52 1H m H 3 核磁共 振碳谱 13C NMR 150 MHz CDCl3 37 3 C 1 31 7 C 2 71 8 C 3 42 3 C 4 140 9 C 5 121 7 C 6 31 7 C 7 31 7 C 8 50 1 C 9 36 2 C 10 21 0 C 11 39 6 C 12 42 1 C 13 56 9 C 14 23 1 C 15 28 3 C 16 55 9 C 17 12 1 C 18 19 7 C 19 42 2 C 20 21 4 C 21 138 3 C 22 129 3 C 23 51 3 C 24 34 0 C 25 21 1 C 26 18 7 C 27 26 1 C 28 12 3 C 29 从以上数据可以看出 该化合物含有 29 个碳 其中有一个羟基碳 信号 71 8 4 个烯碳信号 140 8 121 7 138 3 和 129 3 以上数据与文献报 道的化合物豆甾醇结构一致 23 故鉴定化合物 1 为豆甾醇 Stigmasterol 结构见 图 1 5 3 2化合物 2 结构鉴定 白色针状结晶 MeOH mp 305 307 Liebermann Burchard 反应呈阳性 判断该化合物为甾体或者三萜类化合物 Molish 反应呈阴性 25D 82 3 c 0 96 CHCl3 该化合物负离子 ESI MS 在 m z 455 处给出伪分子离子峰 M H 与其分子式 C30H48O3相符 质谱同时显示了齐墩果酸最特征的发生在 C 环上的 RDA 裂解特征峰 m z 248 m z 208 EI MS m z 248 208 207 203 189 133 IR KBr maxcm 1 3440 OH 1691 COOH 核磁共振氢谱 1H NMR DMSO 谱给出 7 个甲基质子信号 0 66 0 70 0 84 0 86 0 88 3H 6 s 23 24 25 26 29 30 Me 6 1 08 3H s 27 Me 5 15 1H m 12 H 3 位连氧碳质子信号 3 22 1H dd J 10 2 4 2Hz 12 位烯氢质子信号 5 15 1H m H 12 核磁共振碳谱 13C NMR CDCl3 38 4 C 1 27 2 C 2 79 0 C 3 38 7 C 4 55 2 C 5 18 3 C 6 32 6 C 7 39 3 C 8 47 6 C 9 37 1 C 10 22 9 C 11 122 6 C 12 143 6 C 13 41 6 C 14 27 7 C 15 23 4 C 16 46 5 C 17 41 0 C 18 45 9 C 19 30 7 C 10 33 8 C 21 32 4 C 22 28 1 C 23 15 5 C 24 15 3 C 25 17 0 C 26 25 9 C 27 183 0 C 28 33 0 C 29 23 6 C 30 从以上 数据可以看出 该化合物含有 30 个碳 3 位连氧碳信号 79 0 12 13 位特征烯 碳信号 122 6 143 6 28 位羧基碳信号 183 0 以上数据与文献报道的化合物 齐墩果酸结构一致 23 故鉴定化合物 2 为齐墩果酸 Oleanolic acid 结构见图 2 3 3化合物 3 结构鉴定 白色粉状结晶 MeOH mp 277 279 Liebermann Burchard 反应和 Molish 反应均呈阳性 薄层酸水解检出葡萄糖 FAB MS m z 597 M Na 413 395 结合 NMR 数据推出该化合物分子式 C35H58O6 核磁共振氢谱 1H NMR 500MHz C5D5N 谱 5 33 1H d J 3 5Hz 5 22 1H dd J 9 0 15 0Hz 和 5 06 1H dd J 9 0 15 0Hz 为 3 个烯氢质子 表明含有 2 个双键 3 92 5 05 6 示含有糖基 根据糖端基质子 5 05 1H d J 7 5Hz 的偶合常数可以判断为 构型 13C NMR 125Hz C5D5N 显示 34 个碳信号 有一个重叠峰 共 35 个 碳信号 其中 140 9 和 121 9 是典型的 5 6 甾醇类化合物双键碳信号 138 8 和 129 5 是甾醇类化合物的 22 23 双键碳信号 62 9 71 7 75 4 78 1 78 5 102 6 为葡萄糖碳信号 78 6 是与糖上氧相连的苷元碳信号 核磁共振碳谱 13C NMR 125MHz C5H5N 37 0 C 1 30 3 C 2 78 6 C 3 39 4 C 4 140 9 C 5 121 9 C 6 32 1 C 7 32 2 C 8 50 4 C 9 37 5 C 10 21 3 C 11 42 4 C 12 42 5 C 13 56 8 C 14 24 5 C 15 28 6 C 16 56 3 C 17 12 2 C 18 19 4 C 19 36 4 C 20 19 0 C 21 138 8 C 22 129 5 C 23 46 1 C 24 29 5 C 25 20 0 C 26 19 2 C 27 23 4 C 28 12 0 C 29 102 6 C 1 75 4 C 2 78 5 C 3 71 7 C 4 78 1 C 5 62 9 C 6 以上数据与文献报道中的化合物豆甾醇 3 O D 葡萄糖苷的结构一 致 24 故 鉴 定 该 化 合 物3为 豆 甾 醇 3 O D 葡 萄 糖 苷 Stigmasterol 3 O D glucoside 结构见图 3 HO 图1 化合物1的结构式 豆甾醇 7 HO COOH 图2 化合物2的结构式 齐墩果酸 O O OH HO HO HO 图3 化合物3的结构式 豆甾醇 3 O D 葡萄糖苷 4结语 五加属植物中含有多种有效活性成分 我国的五加属植物资源丰富 价格便 宜 具有很大的开发价值 相信随着社会的不断进步 这一资源必将会得到人们 的充分利用 本论文的研究结果对从该植物中寻找更多甾类 三萜活性物质和糙 8 叶五加的综合利用开发 以及植物化学分类学提供了重要的理论依据 对我国天 然药用植物资源的开发利用以及中草药现代化研究具有一定的参考价值 可丰富 五加属植物的研究内容和开发其新的药用部位 为更好地开发和利用湖南特色药 用植物糙叶五加和发展湖南地区中医药特色经济提供一定的理论依据 参考文献 1 中国科学院中国植物志编辑委员会 中国植物志 M 北京 科学出版社 1978 54 86 116 2 中华人民共和国药典委员会 中华人民共和国药典 一部 M 北京 化学工业出版社 2010 192 193 3 韩国药学大学协议会 药典分科会编著 大韩药典 汉城 新日商社 2003 1208 4 倪娜 刘向前 五加科五加属植物的研究进展 J 中草药 2006 37 12 1895 1900 5 Roslida Abdul Hamid Teoh Hui Kee Fezah Othman Anti inflammatory and anti hyperalgesic activities of Acanthopanax trifoliatus L Merr leaves J Pharmacognosy Res 2013 5 2 129 133 6 咸丽娜 李振麟 钱士辉 细柱五加茎中的一个新的贝壳杉烷型二萜苷 J 中草药 2010 41 11 1761 1763 7 Kim JA Song SB Yang SY et a Components from the steamed leaves of Acanthopanax koreanum and their effects on PPAR activity in HepG2 cells J Nat Prod Commun 2011 6 9 1233 1236 8 刘向前 陆昌洙 张承烨 细柱五加皮化学成分的研究 J 中草药 2004 35 3 250 252 9 Kim JA Yang SY Koo JE et al Lupane type triterpenoids from the steamed leaves of Acanthopanax koreanum and their inhibitory effects on the LPS stimulated pro inflammatory cytokine production in bone marrow derived dendritic cells J Bioorg Med Chem Lett 2010 20 22 6703 6707 10 Nhiem NX Kim KC Kim AD et al Phenylpropanoids from the leaves of Acanthopanax koreanum and their antioxidant activity J JAsian Nat Prod Res 2011 13 1 56 61 11 Park SH Nhiem NX Kiem PV et al A new norlupane triterpene from the leaves of 9 Acanthopanax koreanum increases the differentiation of osteoblastic MC3T3 e1 cells J Arch Pharm Res 2010 33 1 75 80 12 Kim SC Kang JI Park DB et al Promotion effect of acankoreoside J a lupane triterpene in Acanthopanax koreanum n hair growth J Arch Pharm Res 2012 35 8 1495 503 13 刘向前 Studies Oil the active constituents of Acanthopanax gracilistylus W W Smith D Korea Kyung He University 2003 14 Nguyen XN Phan VK Chau VM et al Lupane type triterpene glycosides from the leaves ofAcanthopanax koreanum and their in vitro cytotoxicity J Planta Med 2010 6 9 1233 1236 15 邹亲朋 两种五加属植物叶中抗 HMGB1 三萜活性成分研究 D 湖南 中南大学 2012 16 郑礼胜 翁柳娜 刘向前 等 细柱五加叶中抗 HMGB1 总三萜活性物质的闪式提取工 艺 J 中南大学学报 自然科学版 2011 42 7 1890 1898 17 刘向前 邹亲朋 冯胜 等 五加苷对大鼠脑梗死的保护作用 J 药物评价研究 2010 33 2 95 97 18 倪娜 细柱五加叶及其同属植物活性成分研究 D 中南大学 2008 19 刘 向前 Chang S Y Yook C S Lupane triterpenoids from the leaves of Acanthopanax gracilistylus J 兰州大学学报 自然