细胞免疫染色及畸胎瘤切片的制作流程.ppt

复旦大学生物医学研究院 第一部分多能干细胞免疫染色过程 铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照 提纲 铺细胞 ES细胞或iPS细胞的密度要求 无滋养层细胞较好 传代后至克隆形态良好 密度适中 通常传至24孔板中 因为用Hochest染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上 影响克隆定位 Oct4 DAPI 铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照 提纲 材料 细胞的固定 流程 把细胞固定在4 PFA中 室温放置30min 4 多聚甲醛 4 PFA Paraformaldehyde 固定细胞之前 将培养基吸弃 用PBS涮2次 0 1M的PBS配制 PH7 4 100mLPBS加4克多聚甲醛 由于多聚甲醛难溶于水 需用磁力搅拌器加热搅拌 温度控制在60 以下 铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照 提纲 细胞的荧光染色 材料 流程 阳性染色对照 染色呈阴性时 证实染色的有效性阴性染色对照 染色呈阳性时 证实染色的特异性一抗 二抗 Hoechst DAPI 分别发挥如下作用 识别特异抗原 特异一抗及细胞核抗体稀释液 稀释抗体封闭液 封闭非特异性反应 洗涤细胞 透膜 仅限染核抗体 一抗孵育 二抗孵育 染核定位 Hochest 细胞的荧光染色 材料 阳性染色对照 以多能干细胞标记物染色为例 阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞 如ES细胞或经过验证的iPS细胞阴性染色对照 是确定不表达相应抗体的细胞 如成纤维细胞等 一抗 要确保所购买的一抗识别所染细胞的物种 要做预实验以确定最适的抗体浓度二抗 要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型 二者应不同 Hoechst 英文名称 bisBenzimide SigmaB1155 以PBS配制成1mg ml的母液 分装后于 20 保存 常用的可置于4 染色时以1XPBS1000倍稀释 抗体稀释液 0 2 BSA和0 1 TritonX100溶于1XPBS 4 保存 尽量现用现配 因含蛋白成分 容易变质 长菌 封闭液 含1 BSA 4 normalserum 0 4 TritonX100的1XPBS溶液 4 保存 尽量现用现配 因含蛋白成分 容易变质 长菌 细胞的荧光染色 流程 所有洗涤 浸泡步骤都在摇床上进行 目的是为了洗涤 浸泡充分均匀 洗涤 指将平板置于摇床上摇洗3 5分钟 把细胞固定在4 PFA中 室温放置30min 1XPBS洗涤2次 抗体稀释液洗涤两次 无水乙醇中浸泡两次 每次20min 或3次 10min 次 此步仅限于核蛋白染色 如Oct4 Nanog或Rex1等 不能用于膜蛋白 1XPBS洗涤1次 封闭液封闭细胞 室温 1h 将一抗稀释在抗体稀释液中 加到样品上 室温2h或4 放置过夜 以24孔板为例 一抗的体积 200ul 孔 细胞的荧光染色 流程 吸弃一抗 用PBT 0 1 TritonX100inPBS 洗涤细胞3 5次 将二抗稀释在抗体稀释液中 并加到样品孔里 室温放置1h 以24孔板为例 二抗的体积 200ul 孔 注意 从以下步骤开始 样品要注意避光 用PBT洗涤3次 约5min 次 用PBS洗涤两次 5min 次 再用4 PFA室温固定30min 最后再用PBS洗涤两次 每次5min Hoechst染核 室温放置5min 铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照 提纲 观察荧光染色并拍照 iPS细胞染色实例 多能干细胞标记物的常用抗体 膜抗体 SSEA 1 SSEA 3 SSEA 4胞浆抗体 Tra 1 60 Tra 1 81核抗体 Oct4 Nanog Rex1 h 阳性对照 阴性对照 Rat iPSCs 观察荧光染色并拍照 iPS细胞染色实例 阳性对照 阴性对照 h hESCs Tra 1 60 观察荧光染色并拍照 iPS细胞染色实例 Pig iPSCs 观察荧光染色并拍照 iPS细胞染色实例 Human iPSCsEB分化染色 Sox17 AFP Nestin actin SMA Tuj1 内胚层 中胚层 外胚层 第二部分畸胎瘤石蜡切片的制备 畸胎瘤的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的HE染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲 畸胎瘤的获得 ES细胞或iPS细胞的收集 细胞数量 一个T75长到80 90 满时 细胞数大约为1000万个 可以打两个点 即每个点约300 500万个细胞 细胞处理 小鼠及大鼠iPS细胞 将细胞消化成单细胞 1200rpm离心5min后弃上清 以小于400ul的10 DMEM重悬 人iPS细胞 将消化下来的细胞吹打成较小块 静置至细胞团块沉底 并弃上清 以小于400ul的hES培基重悬 收集细胞到1ml注射器内并注射 畸胎瘤的获得 ES细胞或iPS细胞的注射 材料 多重免疫缺陷小鼠 NOD SCID小鼠 注射部位 后腿内侧肌肉注射 畸胎瘤的生长和摘取 畸胎瘤的获得 通常注射30 40天之后 畸胎瘤就长成直径大概1 2cm左右的球体当畸胎瘤长到一定体积时 手术摘除畸胎瘤通常畸胎瘤都是实质性的 也有个别呈空泡状 约1 2cm 畸胎瘤的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的HE染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲 流程 固定 畸胎瘤石蜡切片的制备 包埋 切片 材料 4 PFA 固定畸胎瘤组织用石蜡 熔点约50 60度 包埋组织石蜡包埋机 非必须 包埋组织 还需要包埋盒 包埋底石蜡切片机 必须 切半薄 Semi thick 石蜡切片染色缸 染色架 载玻片 盖玻片溶液 载玻片 防脱片 也可以自制 蛋白胶 涂在切片上晾干 乙醇 EtOH 二甲苯 Xylene 氯仿 Chloroform HE染色液 H Hematoxyline苏木精 E Eosin伊红 封片树脂 染色架 染色缸 捞片 展片 染色 流程 固定 畸胎瘤石蜡切片的制备 在4 PFA中固定 4 浸泡 过夜换成新鲜的4 PFA 再次4 浸泡过夜 过长时间浸在固定液中会降低样品的抗原性 影响后续的免疫染色 4 固定是为了更好的保持标本的抗原性 室温也可以 流程 固定 畸胎瘤石蜡切片的制备 包埋之脱水 透明 70 EtOH1h80 EtOH1h90 EtOH1h95 EtOH1h100 EtOH1hFresh100 EtOH1hFresh100 EtOHovernight 氯仿1h新鲜氯仿1h新鲜氯仿overnight 脱水 透明 流程 畸胎瘤石蜡切片的制备 包埋 石蜡包埋盒 经透明处理的样品 固定 包埋之包埋 流程 固定 畸胎瘤石蜡切片的制备 包埋之包埋 如果没有石蜡包埋机 可以用60 烘箱代替 利用酒精灯加热镊子可代替高温镊子 将样品快速放到石蜡包埋底内 盖上包埋盒的底座 直至石蜡全部凝结 修整蜡块形状 备用 溶解蜡存放槽 出蜡口 冷冻台 高温镊子 石蜡包埋盒和包埋底存放槽 各种规格的石蜡包埋底 用单面刀片修整蜡块 并达到以下要求 1 蜡块呈正方形或长方形 蜡块各面要平直 样品位于蜡块正中央 2 样品边缘与蜡块边缘的距离约3mm 流程 固定 畸胎瘤石蜡切片的制备 包埋之修整蜡块 样品与蜡块边缘有一定距离 以便切片能够连成蜡带 平行 流程 固定 畸胎瘤石蜡切片的制备 包埋 切片 蜡块固定座 刀片 切片厚度微调旋钮 手动切片转轮 切片厚度 5微米 蜡带 毛笔 固定 包埋 切片 捞片 展片 流程 畸胎瘤石蜡切片的制备 37 蒸馏水 载玻片置于37 42 的烘片台 平面 上 样品切片 切片借助水的表面张力展开至平整 吸除多余水分 37 烤片过夜 备用 做好样品ID的标记 流程 畸胎瘤石蜡切片的制备 烤片机37 烤片过夜 防止脱片 展片温水槽温度设定 37 42 左右 固定 包埋 切片 捞片 展片 烤片 畸胎瘤的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的HE染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲 流程脱蜡亲水 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 100 EtOH浸泡2次10min 次 95 EtOH5min90 EtOH5min80 EtOH5min70 EtOH5min 蒸馏水浸洗3次 5min 次 脱蜡 亲水 非一次性使用 可反复多次使用 二甲苯浸泡4次5min 次 流程染色 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色 此步骤称为 盐酸分化 1 盐酸酒精溶液 指染色缸中70 酒精中含1 盐酸 将切片在自来水龙头下流水冲洗15 20分钟 至切片呈理想的紫蓝色 此步骤称 蓝化 颜色的适宜度取决于染色者的经验 蒸馏水中涮洗一下 切片在Eosin溶液中染5min 自来水涮洗至水接近无色 蒸馏水涮洗一下 切片在Hematoxylin溶液中浸泡10min 自来水中涮洗2 3次至水接近无色 蒸馏水中涮洗1次 流程脱水封片 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 100 EtOH浸泡2次10min 次 脱水 二甲苯浸泡4次5min 次 透明 非一次性使用 可反复多次使用 70 EtOHshorttime80 EtOHshorttime90 EtOHshorttime 树脂封片 显微镜下观察 以上几步一方面是为了脱水 另一方面是为了脱去多余的Eosin颜色 所以 要注意观察切片颜色的变化 70 和80 的酒精只要稍稍浸一下即可 90 的酒精是调整颜色的关键步骤 在这一步要依靠染色者根据切片颜色自觉调整时间 新鲜的无水酒精没有脱色作用 流程 畸胎瘤石蜡切片的制备 在样品中央滴一滴封片树脂 固定 包埋 切片 捞片 展片 封片 封片树脂 避免气泡 通风橱内操作为宜 末端蘸有少量二甲苯的盖玻片 畸胎瘤的获得畸胎瘤石蜡切片的制