第8章液固-液液色谱法.ppt

第八章高效液相色谱法 液 固吸附色谱液 液分配色谱 主要内容 液 固吸附色谱法 一 液 液分配色谱法 二 正相硅胶反相洗脱色谱法 三 3 一 液 固吸附色谱法 1 液 固吸附色谱法的定义 液 固吸附色谱是最早出现的 也是最基本的一种柱色谱类型 2 液 固吸附色谱法的固定相 优良的固定相填料应具备以下特性 表面具有极性活性基团即吸附位点 形状适宜 最好成微米级微球形 且粒径分布均匀 多孔性且比表面积大 载样量大 化学性质稳定 机械强度高 价格合理 在吸附色谱中 最常用的吸附剂是硅胶 其次是氧化铝 此外还有高分子多孔微球 有机胶 分子筛及聚酰胺等 固定相按极性大小分类如下 硅胶的性质 硅胶表面主要存在着硅羟基 Silanol 或称硅醇基 和暴露于表面的Si O Si键 另外还有一些硅醇基可能与水以氢键键合 硅羟基的表面浓度在液 固吸附色谱中很重要 因为人们通常认为硅羟基是强吸附位点 而Si O Si则是疏水性的 自由型硅醇基 硅氧烷型 硅胶表面的活性作用点 物理吸附水 干燥表面 硅胶按结构类型分类如下 硅胶 薄壳型 全多孔型 无定形 球形 薄壳玻珠 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶 薄壳玻珠和全多孔微粒硅胶性能比较 1 无定形全多孔硅胶 无定形全多孔的填料容易制备 价格低 粒径一般为5 m 10 m 粒度分布较均匀 理论塔板数可达50000 m 比表面积约300m2 g 载样量大 但涡流扩散大 渗透性差 比较难填装出稳定的柱床 一般用来做制备柱 2 球形全多孔硅胶 球形全多孔填料外形为球形 常用粒径为3 m 5 m 下图为中国科学院兰州化学物理研究所生产的高纯度多孔球形硅胶电镜照 放大3000倍 放大5000倍 2 球形全多孔硅胶 球形全多孔填料具有涡流扩散小 渗透性好的优点 如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话 即堆积硅珠 则具有传质阻抗小 载样量大的优点 柱效也更高 球形填料外形对称 比较容易填装出稳定的柱床 是化学键合相的理想载体 氧化铝 氧化铝与硅胶相似 但对水溶液 酸性或碱性水溶液更加不稳定 所以 极少用作键合固定相的基质 氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性 弱极性的非强离解型的化合物 尤其适合于分离芳香族化合物 当样品为碱性化合物时 用硅胶分离会造成严重吸附 此时可选用氧化铝进行分离 但酸性易离解的化合物容易在氧化铝上形成死吸附 氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶 3 液 固吸附色谱法的保留机理 溶质分子 固定相对它的吸附力 流动相的 拉力 或溶解力 吸附力强而溶解能力差时 溶质有较大的保留 吸附力差而溶解能力强时 溶质有较小的保留 溶质处于这两相作用力场的平衡之中 在吸附色谱体系中 溶剂分子和溶质分子均能被吸附于吸附剂的活性位点上 当流动相流过固定相时 样品组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面吸附中心 同时 样品中不同组分分子也在竞争吸附中心 一是由Snyder和Soczewinski提出的竞争模式 competitionmodel 二是由Scott和Kucera提出的溶剂作用模式 solventiniteractionmodel 双层吸附模型 两种模型 竞争模式 竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中 弱极性或中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附 覆盖于吸附剂表面形成单分子层 当溶质分子进入色谱体系后 便竞争置换 或顶替 溶剂分子而形成吸附 X 溶质分子Y 溶剂分子s 吸附剂m 流动相 双层吸附模型 双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖 双层的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓度 溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代或缔合而使溶质保留 X 溶质分子Y 溶剂分子s 吸附剂m 流动相 流动相 吸附剂 溶质 诱导力 静电力 氢键力 色散力 电荷转移 络合物形成 组分分子中的极性官能团与固定相表面上活性作用点 如硅羟基 之间的相互作用强弱决定了它的竞争能力 即保留程度的大小 这种极性相互作用的强弱归纳如下表所示 硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类 一般保留规律 F化物 Cl化物 Br化物 I化物 顺式几何异构体比反式几何异构体保留值大 官能团之间的分子内氢键将使保留值减小 极性基团旁边有庞大烷基存在时 保留值减小 环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端取代基有更强的保留 4 液 固吸附色谱法的流动相 液 固吸附色谱中使用的流动相为各种有机溶剂 主要为非极性的烃类 如己烷 庚烷 某些有机溶剂 如二氟甲烷 甲醇 三乙胺等 作为缓和剂加入其中以调节流动相的溶剂强度 极性及pH值 即进行所谓正相色谱 流动相溶剂极性越大 洗脱能力越强 溶质保留越小 流动相溶剂极性越小 洗脱能力越弱 溶质保留越大 己烷 环己烷 甲苯 苯 乙醚 氯仿一氯甲烷 丙酮 硝基甲烷 乙腈 丙酮 乙醇 甲醇 己烷环己烷异丙醚甲苯苯乙醚氯仿一氯甲烷二氯甲烷丙酮乙酸乙酯硝基甲烷乙腈丙酮乙醇甲醇 1 混合溶剂 液固色谱中广泛使用混合溶剂 二元 三元体系等 这是因为虽然不同的纯溶剂有不同的溶剂强度 但他们不一定是进行液 固吸附色谱的最佳溶剂强度 我们可以利用不同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度 流动相主体 弱极性的戊烷 己烷 庚烷等 改性剂 调节流动相的洗脱强度与峰形 中等极性 二氯甲烷 氯仿 乙酸乙酯 极性溶剂 四氢呋喃 乙腈 异丙醇 甲醇 水等 碱性物质 如三乙胺等 分离碱性品 避免峰拖尾或不可逆的保留 2 水的影响 硅胶及氧化铝为良好的干燥剂 水的含量对该类吸附剂的活度有很大的影响 即使有极微量的水吸附在其表面上 也会使吸附剂活性大大降低 5 液 固吸附色谱的应用 随着HPLC技术的发展 虽然原来许多使用液 固吸附色谱模式的分离分析被更方便 稳定的化学键合相所代替 但在以下几个方面仍有其独特的意义 1 异构体的分离 许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者是很困难的 而采用以硅胶为固定相的液 固吸附色谱却很容易分开 图液固吸附色谱法拆分苯基丁氨酸衍生物异构体 2 样品预处理 许多生物样品可使用经典液 固吸附色谱来进行纯化 除去蛋白质等干扰物 然后再进一步以GC或HPLC等分离分析 3 制备色谱 由于硅胶比较便易 所以进行分离比较有利 同时流动相为有机溶剂 容易挥发 便于产物提取 4 常用于HPLC GC联用技术 由于流动相为有机溶剂 易于气化 所以目前90 的HPLC GC中的HPLC部分采用液 固吸附色谱 进行正相HPLC 33 二 液 液分配色谱法 1 液 液分配色谱法的定义 液 液分配色谱 基于样品组分在固定液和流动相之间分配系数不同而分离的色谱法称为液 液分配色谱法 Liquid LiquidChromatography LLC 流动相极性小于固定相极性的液 液色谱法称为正相液 液色谱法 如以烷烃作为流动相 以含水硅胶作为固定相的色谱系统 正相液 液色谱法适合于分离极性化合物 流动相极性大于固定相极性的液 液色谱法称为反相液 液色谱法 如以水为流动相 烷烃为固定相的色谱系统 反相液 液色谱法适合于分离芳烃 稠环芳烃及烷烃等化合物 这两种系统由于固定液易流失 重复性差 已被键合相色谱法所代替 但正相液 液分配色谱法在薄层色谱法中还广泛使用 液 液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液 涂渍了固定液的载体 1 流动相 2 固定液液膜 3 毛细深孔和渗入的固定液 4 液固界面 5 液液界面 2 液 液分配色谱法的固定相 1 载体 原则上 所有多孔性的吸附材料均可作为固定液的载体 一般常用硅胶 硅藻土等 结构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型二种 多孔层微珠 柱效好 分析时间短 但它的多孔层很薄 只能涂渍少量固定液 最大涂渍1 2 故柱容量低 柱稳定性也差 因为少量的固定液流失将大大改变保留体积 全多孔微粒 全多孔微粒 如硅胶 孔容大 1ml g 可涂渍较多的固定液 涂渍量可达1克固定液 每克载体 称为100 涂渍 其柱效比前者高 且柱容量高 柱子稳定性也好 载体上涂渍的固定液越多 则因固定液流失对样品保留体积的影响就越不显著 理想的载体应该具有如下特点 孔容大 孔径应为100 500埃之间 孔径太小 较大的分子可能被完全排阻 而保留时间更短 分离不佳 孔径太大 则固定液易流失 柱稳定性差 由于毛细管作用 固定液在小孔要比大孔内保持的好 理想的载体 2 固定液 固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液 如不同聚合度的聚乙二醇 甲酰胺 丙撑二醇等 然而 对这些固定液 适合作为流动相的只有非极性链烃 最多再加入少量 最高10 的氯仿 四氢呋喃和其它醚类 所有常见的洗脱液都是这些固定液的良溶剂 但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶解度很小 所以这类体系的适用性是有限的 液 液分配色谱法的固定液的选择也可参考纸色谱法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配体系 如在纸色谱里 甾体药物可以在浸渍甲酰胺的纸上容易地分离 如果把甲酰胺涂在硅胶上 那么甾族化合物就能用高效液相色谱分离 因为甲酰胺即使在中等极性的溶剂苯 二氯甲烷中也几乎是不溶解的 载体的涂渍采用GC中常用的固定液涂渍方法 3 液 液分配色谱法的保留机理 液 液分配色谱法的保留机理是根据样品组分溶入固定相 s 与流动相 m 达到 平衡 后的分配系数K的差异而分离 m 流动相s 固定液Xm 在流动相中的溶质分子Xs 在固定液中的溶质分子 分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似 当流动相体积和固定液体积一定时 物质在固定液中的溶解度越大 分配系数越大 保留时间越长 反之 在固定液中的溶解度越小 分配系数越小 保留时间越小 4 液 液分配色谱法的流动相 在液 液分配色谱中 流动相一般采用与固定液性质相差很大的不混溶的溶剂为流动相 流动相对固定相的溶解度尽可能小 因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端 例如当选择固定液是极性物质时 所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂 流动相使用前需预先用固定液饱和 或在分析柱前增加预饱和柱 以避免固定液流失 45 三 正相硅胶反相洗脱色谱法 NS RE的简介 1975年Jane首次报道在普通正相硅胶柱上 用强极性的水为流动相成功分离了碱性药物 1987年Law研究了这种称之为正相硅胶 反相洗脱 NS RE 色谱中碱性药物的保留机理 认为其保留主要由于离子交换所引起 NS RE具有不需反相高效液相色谱 RP HPLC 中复杂的处理手段 碱性药物保留时间大大缩短及拖尾改善 峰形对称等优点 是一种分析中药中的生物碱成分 或化学合成的生物碱类药物及其代谢物的简便 有效 理想的方法 1 固定相 本法采用未改性的原形硅胶为固定相 以水性溶液作流动相 以普通硅胶作固定相简单 方便 不需HPLC众多的键合相就能达到满意的分离效果 在高pH值 pH 8 的水 有机溶剂混合液中 固定相稳定 硅胶不溶于高浓度极性有机溶剂 高pH值的流动相中 可使用数月不影响柱效 2 保留机理 NS RE对碱性药物的保留主要是由于离子交换机理 在高pH值的条件下 硅胶表面弱酸性的硅羟基存在一定的离子化特征 因而硅胶在高pH值的情况下可作为阳离子交换剂 而许多碱性化合物在高pH值 pH10 时也能部分质子化 这样NS RE中具备了阳离子交换的物质条件 NS RE系统种组分主要依碱性强弱出峰 色谱峰的对称性很好 峰形尖锐 3 流动相 NS RE法常用的流动相为甲醇 水相缓冲液或乙腈 水相缓冲液 合适的缓冲剂有三乙胺 硝酸铵 氨水 甲酸铵 氨水 高氯酸铵 氨水 醋酸铵 氨水及磷酸氢二铵 磷酸等 由于NS RE利用被测组分与硅醇基相互作用 因此不需要加硅醇基掩蔽剂等特殊添加剂 仅用一 二种洗脱液就能对大范围内的碱性药物进行分离分析 4 影响色谱保留因素 保持流动相一定的pH值和离子强度 随着流动相中水的比例增加 洗脱能力减小 流动相中三乙胺浓度升高 对含碱性基团组分的洗脱能力提高 保留时间缩短 三乙胺为阴离子竞争离子 用于竞争硅羟基 以消除硅羟基对生物间的吸附 碱性组分的保留随缓冲盐浓度的增加 离子强度增加 而减少 这与典型的离子交换系统类似 固定相 Radial PAK硅胶 流动相 乙腈 水 60 40 pH7 8 1 异丙嗪2 扑尔敏3 奎尼丁 离子强度对保留的影响 4 影响色谱保留因素 pH值对NS RE的色谱保留具有两面性 随pH值的增加 碱性药物的保留先增加后减小 pH对保留的影响 固定相 Radial PAK硅胶 流动相 乙腈 水 60 40 4mmol LNaCl 1 异丙嗪2 去甲麻黄碱3 奎尼丁 4 影响色谱保留因素 在实际操作中流动相的pH值以6 7为好 原因有三 pH太低 硅羟基失去离子交换能力 pH值太高 弱碱性药物不易离子化 pH值太高 硅胶在碱性溶液中有一定的溶解度 4 影响色谱保留因素 由于硅氧烷基的疏水特性 非解离型物质在该系统的出峰顺序类似于RP HPLC 5 柱子的培养 由于流动相中含有三乙胺 三乙胺吸附在硅羟基上 很难以甲醇清洗 所以每次做完样品 先以0 1 冰乙酸冲洗15min 20min 洗去三乙胺 然后再用甲醇冲洗20min 经这样处理后 柱压可长期保持不变 达到保护柱子的目的 6 正相硅胶 反相洗脱的应用 NS RE能同时分析极性范围很大的一类药物 且分离效果好 分析时间短 在体内药物分析中 NS RE也是一种良好的分析方法 NS RE在高浓度极性有机