发酵工程 第七章 发酵动力学.ppt

第七章发酵动力学 生物反应分类 一 通过细胞培养 利用细胞产生的酶系统 把培养基中的物质转化成新的细胞及其代谢产物 底物新的细胞 代谢产物二 在酶的作用下 底物反应生成产物 淀粉糊精 低聚糖 细胞 淀粉酶 发酵的目的 获得产物 提高发酵生产率 即提高微生物的催化与转化能力 降解有害底物 保护环境 降解废弃底物 形成生物能源产品 降解长链烃底物形成发酵产物 促进采油 发酵研究的关键问题 提高生物催化与转化能力 分子水平酶催化反应活性酶基因表达调控细胞水平一系列酶促反应的交互细胞水平的综合细胞生长 底物消耗 产物合成反应器水平一系列细胞酶促反应的集成规模放大对细胞及分子水平的影响及控制 优化发酵过程达到高产目标的方法 提高转化率和效率的三个方面 发酵动力学研究对现有微生物本征动力学认识 弄清不同水平的主要影响因素和控制措施 菌种选育改造 修饰和构建工程措施反应器结构及操作性能优化 提高混合 传热 传质以及细胞间的信号传递 调控细胞群体的发酵能力 发酵动力学研究方法 基于细胞水平展开 包括活细胞 休眠细胞 休止细胞或静止期细胞 和死亡细胞形成产物过程的定量研究 什么是发酵动力学 发酵动力学 研究微生物生长 产物合成 底物消耗之间动态定量关系 定量描述微生物生长和产物形成过程 主要研究 1 发酵动力学参数特征 微生物生长速率 发酵产物合成速率 底物消耗速率及其转化率 效率等 2 影响发酵动力学参数的各种理化因子 3 发酵动力学的数学模型 一 认识发酵过程的规律 二 合理设计的发酵过程 确定最优发酵过程参数 如 基质浓度 温度 pH 溶氧 等等 确定最佳发酵工艺条件 三 提高发酵产量 效率和转化率等 研究发酵动力学的目的 生化反应 aA bB cC dD 反应动态平衡改变条件破坏平衡 如何能最快最多的获得目的产物 温度 酸碱度 浓度 催化剂 采用反应动力学方法进行定量研究 动力学主要探讨反应速率问题 课程重点 主要针对微生物发酵的表观动力学 通过研究微生物群体的生长 代谢 定量反映细胞群体酶促反应体系的宏观变化速率 主要包括 细胞生长动力学底物消耗动力学产物合成动力重点定量研究底物消耗与细胞生长 产物合成的动态关系 分析参数变化速率 优化主要影响因素 但研究过程中将涉及三个层次的研究方法 达到认识微生物本质特征 解决发酵工业问题的目的 发酵动力学研究的基本过程 首先研究微生物生长和产物合成限制因子 建立细胞生长 基质消耗 产物生成模型 确定模型参数 实验验证模型的可行性与适用范围 根据模型实施最优控制 本章主要内容 分批发酵动力学连续发酵动力学补料分批发酵动力学 什么是分批发酵 分批发酵 准封闭培养 指一次性投料 接种直到发酵结束 属典型的非稳态过程 分批发酵过程中 微生物生长通常要经历延滞期 对数生长期 衰减期 稳定期 静止期 和衰亡期五个时期 典型的分批发酵工艺流程图 分批发酵过程 t1t2t3t4t5 分批发酵时典型的微生物生长动力学曲线 菌体浓度X 时间t 分批发酵动力学 细胞生长动力学 微生物细胞倍增时间与群体生长动力学细菌 典型倍增时间1hr酵母 典型倍增时间2hr放线菌和丝状真菌 典型倍增时间4 8hr微生物细胞群体生长动力学是反映整个群体的生长特征 而不是单个微生物生长倍增的特征 因此 菌龄是指一个群体的表观状态 关于菌龄的描述 分批发酵动力学 细胞生长动力学基质消耗动力学产物形成动力学 微生物生长特性通常以单位细胞浓度或细胞数量在单位时间内的增加量来表示 n 或 X 细胞浓度 g L N 细胞个数 t 生长时间 X0 Xt 初始微生物浓度和t时细胞浓度 N0 Nt 初始细胞个数和t时细胞个数 以细胞浓度表示的比生长速率 以细胞数量表示的比生长速率 分批发酵动力学 细胞生长动力学 lag x不变 即exp 假定无抑制作用存在 分批发酵动力学 细胞生长动力学 Decline 开始出现一种底物不足的限制 1 若不存在抑制物时Monod模型 分批发酵动力学 细胞生长动力学 S 限制性基质浓度 mol m3Ks 底物亲和常数 也称半饱和速度常数 表示微生物对底物的亲和力 mol m3 Ks越大 亲和力越小 越小 当S较高时 对数期满足S 10Ks 此时 m 当S较低时 减速期 S 10Ks 此时S 减速期 分批发酵动力学 细胞生长动力学 比生长素率 限制性底物残留浓度St 残留的限制性底物浓度对微生物比生长率的影响 表征 与培养基中残留的生长限制性底物St的关系 Monod方程 Ks 底物亲和常数 等于处于1 2 m时的底物浓度 表征微生物对底物的亲和力 两者成反比 酶促反应动力学 米氏方程 受单一底物酶促反应限制的微生物生长动力学方程 Monod方程 Monod方程应用 测定微生物对不同底物的亲和力大小 Ks值 实验确定适于微生物生长的最佳底物 比较不同底物发酵最终残留的大小 比较不同微生物对同一底物的竞争优势 确定连续培养的稀释率 Stationary 不生长或生长率与死亡率相等 dying 浓度最大 分批发酵动力学 细胞生长动力学 比死亡速率 s 1 分批发酵动力学 假定整个生长阶段无抑制物作用存在 则微生物生长动力学可用阶段函数表示如下 0 x0 0 t t1 mx0e mt t1 t t2 x x0e m t2 t1 e t t2 t t3 0 xm t3 t t4 axme at t4 t t5 其它模型1 在无抑制作用情况下 但有底物限制存在 分批发酵动力学 细胞生长动力学 式中n为常数x为细胞浓度 培养液中有抑制物的情形 高浓度基质抑制存在的情况下式中 Kis为抑制常数 抑制作用越强 Kis越小 分批发酵动力学 细胞生长动力学 其它模型2 高浓度产物抑制的情况下 线性 指数 产物积累一定量才有抑制作用 分批发酵动力学 细胞生长动力学 其它模型2 其中 k k1 k2为常数 分批发酵中初始底物浓度对稳定期菌体浓度的影响 A B区 菌体浓度与初始底物浓度成正比 有 X为菌体浓度 为针对底物的细胞得率 初始X0为零 S0为底物初始浓度 St为底物残留浓度 B C区 随S0增加 菌体浓度达最高水平 再增加S0 菌体不再增加 C区 菌体活性受初始高浓度底物及高渗作用抑制 菌体浓度与初始底物浓度成反比 高浓度底物抑制的情形 当培养基中存在多种限制性营养物时 Monod方程应改为 分批发酵动力学 得率系数 指消耗单位营养物所生成的细胞或产物数量 其大小取决于生物学参数 x 和化学参数 DO C N 磷含量等 1 生长得率系数 Yx s Yx o Yx kcal 消耗每克营养物 每克分子氧以及每千卡能量所生成的细胞克数 Yx c Yx N Yx p Yx Ave 消耗每克C 每克N 每克P和每个有效电子所生成的细胞克数 Yx ATP 消耗每克分子的三磷酸腺苷生成的细胞克数 分批发酵动力学 基质消耗动力学 消耗每克营养物 s 或每克分子氧 O2 生成的产物 P ATP或CO2的克数 分批发酵动力学 基质消耗动力学 产物得率系数 定义 表观得率专一性得率 专一性用于生长的底物量 S 不含用于维持能耗及产物形成部分的用量 分批发酵动力学 基质消耗动力学 基质消耗速率与生长 合成关系如下 表观 专一性 分批发酵动力学 基质消耗动力学 为了扣除细胞量的影响 定义 基质比消耗速率产物比生成速率 分批发酵动力学 基质消耗动力学 若生长阶段产物生成可以忽略 即 分批发酵动力学 基质消耗动力学 1 Yx s 1 1 YG m 图解法求微生物的本征参数YG和m 分批发酵动力学 基质消耗动力学 若生产阶段微生物生长可以忽略 分批发酵动力学 基质消耗动力学 图解法求微生物的本征参数Yp和m 1 Yp s 1 qp m 1 YP 根据发酵时间过程分析 微生物生长与产物合成存在以下三种关系 与生长相关 生长偶联型与生长部分相关 生长部分偶联型与生长不相关 无关联 分批发酵动力学 产物形成动力学 相关型 部分相关型 与生长相关 生长偶联型 乙醇发酵 产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果 菌体生长速率的变化与产物生成速率的变化相平行 分批发酵动力学 产物形成动力学 与生长部分相关 生长部分偶联型 柠檬酸 氨基酸发酵 产物间接由能量代谢生成 不是底物的直接氧化产物 而是菌体内生物氧化过程的主流产物 与初生代谢紧密关联 分批发酵动力学 产物形成动力学 与生长不相关 无关联 抗生素发酵 若考虑到产物可能存在分解时 则 产物生成与能量代谢不直接相关 通过细胞进行的独特的生物合成反应而生成 分批发酵动力学 产物形成动力学 分批发酵动力学 杀假丝菌素分批发酵动力学分析 杀假丝菌素分批发酵中的葡萄糖消耗 DNA含量和杀假丝菌素合成的变化 应用举例 分批发酵的优缺点 优点 操作简单 投资少运行周期短染菌机会减少生产过程 产品质量较易控制缺点 不利于测定过程动力学 存在底物限制或抑制问题 会出现底物分解阻遏效应 及二次生长 现象 对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等就不适合用分批发酵 生长与合成条件差别大 养分会耗竭快 无法维持微生物继续生长和生产非生产时间长 生产率较低 连续发酵动力学 什么是连续发酵 连续发酵概念 在发酵过程中 连续向发酵罐流加培养基 同时以相同流量从发酵罐中取出培养液 连续发酵特点 添加培养基的同时 放出等体积发酵液 形成连续生产过程 获得相对稳定的连续发酵状态 连续发酵类型 单级连续发酵多级连续发酵 一 连续发酵类型及装置 二 连续发酵动力学模型1 单级恒化器连续发酵2 多级恒化器连续发酵3 进行细胞回流的单级恒化器连续发酵 三 连续发酵动力学理论的应用 主要内容 连续发酵类型及装置罐式连续发酵单级多级串联细胞回流式塞流式连续发酵 连续发酵动力学 发酵装置 单级连续发酵示意图 连续发酵动力学 发酵装置 单级 两个及以上的发酵罐串联起来 前一级发酵罐的出料作为下一级发酵罐的进料 连续发酵动力学 发酵装置 多级串联 两级连续发酵示意图 罐式连续发酵实现方法恒浊法 通过调节营养物的流加速度 利用浊度计检测细胞浓度 使之恒定 恒化法 保持某一限制性基质在一恒定浓度水平 使菌的比生长速率 保持一定 多级罐式连续发酵装置示意图 连续发酵动力学 发酵装置 多级串联 a 再循环比率 回流比 c 浓缩因子 细胞回流的单级连续发酵示意图 连续发酵动力学 发酵装置 细胞回流式 发酵罐 培养物流出 无菌培养基流入 供给连续接种再循环 d 连续发酵动力学 发酵装置 塞流式 定义 稀释率D F V h 1 F 流量 m3 h V 培养液体积 m3 理论停留时间 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 细胞的物料衡算 和D的关系 对于单级恒化器 X0 0且通常有 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 积累的细胞 净增量 流入的细胞 流出的细胞 生长的细胞 死亡的细胞 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 A 稳定状态时 此时 D 单级连续发酵重要特征 B 不稳定时 当 D 当 D 积累的营养组分 流入量 流出量 生长消耗量 维持生命需要量 形成产物消耗量稳态时 0 一般条件下 mx 产物相对菌体生长量较少 限制性基质的物料衡算 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 稳态时 单级连续培养两个稳态方程是 限制性基质的物料衡算 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 两个稳态方程隐含了几点假设 Yx s对于一个特定微生物及具体操作参数 D 来讲是常数Yx s只受一种限制性营养基质S的影响 S一定 一定 则Yx s一定 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 细胞浓度与稀释率的关系 x与D的关系 临界稀释率Dc导致菌体开始从系统中洗出时的稀释率 当流入底物浓度为S0时 临界稀释率Dc为 稀释率D的大小不能超过连续发酵系统的临界稀释率 如果取D DC 则会出现 D DC 由可知负增长 x 进入非稳态 菌体最终被洗出 即x 0时 达到 清洗点 此时 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 细胞浓度与稀释率的关联 X与D的关系 应用Monod方程 此时 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 生长模型 由两个稳态方程可以推出D与X关联的生长模型当D DC时 细胞衡算底物衡算 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 细胞生产率 细胞生产率当即时 可获得最大的细胞生产率 为 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 细胞生产率 若S0 Ks S0 10Ks 底物供给浓度很大 为非限制性则此时 最大临界稀释率 当D Dc 时 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 产物的物料衡算 产物变化率 细胞合成产物速率 流入 流出 分解项当连续发酵处于稳态 且加料中不含产物 即 P分解速率可忽略 得 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 x s Dx与D关系总结 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 实例 几个假设 只受单一底物限制 Yx s对一定的 来讲 为常数 D DC若已知 考察 稀释率 D 对细胞浓度 X 细胞生产率 DX 和底物浓度 S 的影响 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 稀释率 D 对底物浓度 S 细胞浓度 x 和细胞生产率 DX 的影响 连续发酵动力学 理论 单级恒化器连续发酵 多级恒化器的第一级动力学模型 假设两级发酵罐内培养体积相同 即V1 V2 且第二级不加入新鲜培养基 则对于第一级动力学模型 方程 与单级相同 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 稳态时 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 多级恒化器的第二级动力学模型 S1 S0 S2 S1从第二级开始 比生长速率不再等于稀释率D 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 第二级细胞物料衡算 第二级稳态时 同理 由稳态方程可得 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 第二级基质物料衡算 稳态时 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 第二级基质物料衡算 S2的求解 解此方程可得第二级发酵罐中稳态限制性基质浓度S2 再由式 2 可确定x2 再求出Dx1 Dx2 1 3 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 细胞形成产物的速率 DP2 稳态时 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 第二级发酵罐产物浓度 同理类推 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 例题 已知某一微生物反应 其细胞生长符合Monod动力学模型 其 试问 1 在单一CSTR 连续搅拌式反应器 进行反应 稳态下操作且无细胞死亡 欲达到最大的细胞生产率 其最佳稀释率是多少 2 采用同样大小N个CSTR相串联 其D值相同 若要求最终反应基质浓度降至1g L以下 试求N至少应为多少级 解 看一下N 3时的情况 二级连续发酵中不同稀释率下的稳态细胞浓度 限制性基质浓度和细胞生产率的变化 连续发酵动力学 理论 多级恒化器连续发酵 进行细胞回流的单级连续发酵 概念 进行单级连续发酵时 把发酵罐流出的发酵液进行分离 经浓缩的细胞悬浮液送回发酵罐中 a 再循环比 回流比 a1 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 优点 提高了发酵罐中的细胞浓度和底物的转化率 也有利于提高系统的操作稳定性 细胞生长动力学方程 细胞的物料衡算 与D的关系 积累的细胞 进入培养液中的细胞 再循环流入的细胞 流出的细胞 生长的细胞 死亡的细胞 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 假定 细胞死亡很少 0 培养基无菌加入 x0 0 D F V由稳态条件得 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 限制性基质的物料衡算 x1与D的关系 积累的基质 进入基质 循环流入基质 流出基质 消耗的基质 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 x1与D的关系 代入 有 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 D F V 稳态时 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 x1比单级无再循环的x要大 又 代入x1式 得 最终流出的细胞量xe与D关系 假定分离器无细胞生长和基质消耗 则有细胞物料衡算式 流入分离器细胞 流出分离器细胞 再循环细胞 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 举例 单级细胞再循环连续培养的应用 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 设系统的 对于回流系统有 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 对于无回流系统有 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 连续发酵动力学 理论 细胞回流单级恒化器连续发酵 细胞回流与不回流的单级连续发酵比较A 细胞回流时的稳态X B 细胞回流时的稳态DX C 细胞回流时的稳态Xe D 细胞不回流时的稳态X E 细胞不回流时的稳态DX 应用 有助于了解和研究细胞生长 基质消耗和产物生成的动力学规律 从而优化发酵工艺 便于研究细胞在不同比生长速率下的特征 连续发酵动力学 理论 利用细胞再循环连续发酵技术进行废水的生化处理 发酵与产物分离耦合 解除负反馈抑制 提高产量 利用连续培养的选择性进行富集培养菌种选择及防污染处理 应用 连续发酵动力学 理论 连续发酵动力学 理论 在底物浓度为S情况下杂菌Y的生长速率 y比系统的稀释速率D要小Y的积累速率 结果是负值 表明杂菌不能在系统中存留 连续发酵动力学 理论 底物浓度为S的情况下杂菌Z能以比D大的比生长速率下生长 比D大的多 故dZ dt是正的 杂菌Z积累 系统中底物浓度下降到S 此时 D 建立新的稳态 此时生产菌X的比生长速率比原有的小 D 故将生产菌从系统中淘汰 连续发酵动力学 理论 杂菌W入侵的成败取决于系统的稀释速率 由图可见 在稀释速率为0 25Dc 临界稀释速率 下 W竞争不过X而被冲走 连续培养中杂菌能否积累取决于它在培养系统中的竞争能力 应用 遗传稳定性研究连续发酵提高生产率 连续发酵动力学 理论 分批发酵 生产周期式中 tL 延迟期所占用时间 tR 放料时间tP 清洗发酵罐 培养基 灭菌 冷却所需时间xF 发酵终点细胞浓度 x0 接种后细胞浓度假定分批发酵的指数生长期延续到限制性基质耗尽 这时达到最大细胞浓度xF 应用 提高生产率 连续发酵动力学 理论 分批发酵的细胞生产率为 连续发酵动力学 理论 应用 提高生产率 可见 细胞的 m越大 辅助操作时间越长 连续发酵的优势就越大 应用 单级连续发酵最大生产率 连续发酵动力学 理论 单级连续发酵与分批发酵最大生产率之比为 实验数据如下 t24h 生长罐 48h 生产罐 60hP1 0 07g LP2 0 4g LP3 0 62g LX1 7g L求操作参数D 并比较连续发酵与分批发酵的生产率 应用 青霉素连续发酵与分批发酵对比 计算 采用连续发酵时第一罐 第二罐 由 为了保证串联稳定 两罐稀释率差异用体积差异进行调节 F相同产物在串联系统停留时间产物形成速率 而分批发酵时 tn 48h P 0 4g L故产物形成速率DP 0 4 48 0 0083g L h 比连续发酵低 为充分利用基质 再加一罐 第三罐 相当于60h tn 1 D1 1 D2 1 D3 53 7h产物形成速率P3 tn 0 0115g L h分批发酵P3 t3 0 62 60 0 0103g L h 优缺点 添加新鲜培养基 克服养分不足所导致的发酵过程过早结束 延长对数生长期 增加生物量等 在长时间发酵中 菌种易于发生变异 并容易染上杂菌 如