DEAE sephrose FF说明及使用

DEAE 琼脂糖凝胶 FF 的详细资料 英文名称 DEAE Sepharose FF CAS 号 57407 08 6 级 别 BR 凝胶类型 离子交换填料 弱碱型 结构成分 6 交联琼脂糖 粒 径 45 165 m 配基基团 diethylaminoethyl 二乙氨乙基 蛋白质吸附量 110mgHSA ml 凝胶 总离子交换量 0 11 0 16mmol ml 凝胶 交换载量 3 1mg Thyroglobulin ml drained medium 110 mg HSA ml drained medium 100mg lactalbumin ml drained medium 流 速 300 600 cm h 最大流速 750 cm h 工作 PH 值 2 9 工作温度 4 40 PH 稳定性 1 14 短时间 在位清洗 2 12 长时间 耐 压 0 3MPa 性 状 白色微球 凝胶状 含 20 乙醇 底部为乳白色胶体 用 途 生化研究 适用于各种带负性电荷生物大分子的浓缩纯化等 利用离子交换 作用 应 用于蛋白等生物分子的快流速高产量纯化等 保 存 2 8 包 装 100 毫升 瓶 500 毫升 瓶 1 升 瓶等 离子交换层析分离蛋白质 实验目的 通过分离蚓激酶的实验 学习和掌握离子交换层析法的工作原理和离子 交换介质的选择 了解离子交换树脂的处理及转型 学习该实验方法的筛选和基本操 作技术 实验原理 离子交换层析是一种吸附层析 利用不同蛋白质表面电荷的差异而达到 分离 纯化蛋白质的目的 阴离子交换剂的电荷基团带正电 反离子带负电 因此这种 交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应 阳离子交换剂则反之 实验材料 0 05M Tris HCl pH7 5 1M NaCl 0 05M Tris HCl pH7 5 蚓激酶粗提物 20 乙醇 1MNaOH DEAE Sepharose Fast Flow 柱 AKTA purifier 液谱纯化系统 高速离心机 电子天平 试管 一次性滤器 2ml 注射器 2ml Eppendorf 管 冲洗瓶 玻璃滤器 实验方法 1 离子交换介质 选用 Hitrap DEAE SepharoseFF 阴离子交换层析柱 蚓激酶的 pI 为 3 5 4 0 洗脱缓冲液为 pH7 5 此时 pI pH 目的蛋白带负电荷 故选择阴离子交 换介质 2 洗脱缓冲液的选择 选用起始洗脱液为 0 05M Tris HCl pH7 5 洗脱液的离子强度及 pH 可根据具体实验情况而定 一般情况下 起始缓冲液的离子强度应高于 10 20mmol L 3 样品的准备 称取 30mg 蚓激酶用起始洗脱液 1 5ml 溶解配制成 20mg ml 溶液 10 000 g 离心 5min 或 0 22um 膜过滤除去杂质 取上清进样 4 进样 将样品加入样品环 输入进样程序 5 设定洗脱条件 起始洗脱液 0 05M Tris HCl pH7 5 5 1 梯度洗脱液 1M NaCl 0 05M Tris HCl pH7 5 5 2 洗脱流速 1ml min 5 3 平衡 5CV 后作梯度洗脱 梯度为 0 1M NaCl 20CV 5 4 梯度洗脱后再次平衡 5CV 5 5 再生 1M NaOH 反洗 3CV 5 6 保存 20 乙醇 4 保存 注意事项 1 实验用缓冲液均需过滤除去杂质 除去溶液内气体 2 使用的样品必须过滤或离心除去不溶物 以保持层析柱的使用寿命 3 层析柱使用 后必须再生 保持层析柱使用寿命 4 选择洗脱液的 PH 及起始离子强度要合适 DEAE Sepharose FF 离子交换层析 装柱 20mmol L pH7 5 的 Tris 一 HCl 缓冲液冲洗柱子 缓缓倒入 DEAE Sepharose FF 湿胶约 30 ml 待分成后 倒去乙醇溶液 再次加入 20mmol L pH7 5 的 Tris 一 HCl 缓冲液 平衡 装柱后 使用 20mmol L pH7 5 的 Tris 一 HCl 缓冲 液冲洗柱子 速度约为 1ml min 平衡时间为 5h 以上 直至液相层析系统记录器显示 为基准线 上样和洗涤 脱盐浓缩后的蛋白质样品液 5ml 上样于离子交换柱 用 20mmol L pH7 5 的 Tris 一 HCl 缓冲液冲洗 直至冲洗去除杂蛋白后 仪器紫外检测仪 出现平稳吸光值 即待穿透峰出现后 洗脱 用浓度为 0 1 0 15 0 2 0 25 0 3 0 35 0 4 0 45 0 5mol L 浓