溶菌酶实验-实验报告-第七组

溶菌酶的提取和系列性质测定溶菌酶的提取和系列性质测定 实验报告实验报告 学院 学院 生物科学与工程学院生物科学与工程学院 班级 班级 姓名 姓名 学号 学号 组别 组别 第七组第七组 组员 组员 一 实验内容 一 实验内容 溶菌酶的提取和系列性质测定溶菌酶的提取和系列性质测定 在研究酶的性质 作用 反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶 制剂以避免干扰 酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用 才能得到较 为满意的效果 常用的提纯方法有盐析 有机溶剂沉淀 选择性变性 离 子交换层析 凝胶过滤 亲和层析等 酶蛋白在分离提纯过程中易变性失 活 为能获得尽可能高的产率和纯度 在提纯操作中要始终注意保持酶的 活性如在低温下操作等 这样才能收到较好的分离提纯效果 溶菌酶又称胞壁质酶或 N 乙酰胞壁质聚糖水解酶 球蛋白 G 是一种 能水解致病菌中黏多糖的碱性酶 主要通过破坏细胞壁中的 N 乙酰胞壁酸 和 N 乙酰氨基葡糖之间的 1 4 糖苷键 使细胞壁不溶性黏多糖分解成可 溶性糖肽 导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解 溶菌酶还可与带负 电荷的病毒蛋白直接结合 与 DNA RNA 脱辅基蛋白形成复盐 使病毒失 活 溶菌酶相对分子质量约为 1 44 104 是一种强碱性蛋白质 等电点在 10 0 以上 并对温度和酸不敏感 在自然界中 普遍存在于鸟类和家禽的 蛋清中 哺乳动物的泪 唾液 血浆 尿液 淋巴液等细胞中 植物卷心 菜 萝卜 木瓜等 以蛋清含量最丰富 约为 0 3 本实验用鸡蛋为原理 通过阳离子交换层析 硫酸铵沉淀 分子筛层 析等步骤提取溶菌酶 二 实验原理 二 实验原理 1 1蛋白质提取分离技术蛋白质提取分离技术 以蛋白质和结构与功能为基础 从分子水平上认识生命现象 已经成为 现代生物学发展的主要方向 研究蛋白质 首先要得到高度纯化并具有生 物活性的目的物质 蛋白质的制备工作涉及物理 化学和生物等各方面知 识 但基本原理不外乎两方面 一是得用混合物中几个组分分配率的差别 把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中 如盐析 有机溶剂 提取 层析和结晶等 二是将混合物置于单一物相中 通过物理力场的作 用使各组分分配于来同区域而达到分离目的 如电泳 超速离心 超滤等 在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性 防止酸 硷 高温 剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失 蛋白质的制备一般 分为以下四个阶段 选择材料和预处理 细胞的破碎及细胞器的分离 提 取和纯化 浓细 干燥和保存 微生物 植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料 所选用的材料主 要依据实验目的来确定 对于微生物 应注意它的生长期 在微生物的对 数生长期 酶和核酸的含量较高 可以获得高产量 以微生物为材料时有 两种情况 1 得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等 2 利用菌体含有的生化物质 如蛋白质 核酸和胞内酶等 植物材料必 须经过去壳 脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同 其中所含生物大 分子的量变化很大 另外与季节性关系密切 对动物组织 必须选择有效 成份含量丰富的脏器组织为原材料 先进行绞碎 脱脂等处理 另外 对 预处理好的材料 若不立即进行实验 应冷冻保存 对于易分解的生物大 分子应选用新鲜材料制备 2 柱层析技术柱层析技术 柱层析技术也称柱色谱技术 一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相 将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱 溶剂组成流动相 在 样品从柱子上洗脱下来的过程中 根据蛋白质混合物中各组分在固定向和 流动相中的分配系数不同经过多次反复分配 将不同蛋白组分逐一分离 根据填充基质和样品分配交换原理不同 离子交换层析 凝胶过滤层析 和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术 3 电泳技术电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构 具有分子筛效应 它具有两种形式 一 种是非变性聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质在电泳中保持完整的状态 蛋白在其 中依三种因素分开 蛋白大小 形状和电荷 而 SDS PAGE 仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白 这个技术首 先是 1967 年由 shapiro 建立 他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂和强还原剂后 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子 量的大小 电荷因素可以忽视 SDS 是阴离子去污剂 作为变性剂和助溶试剂 它能断裂分子内和分 子间的氢键 使分子去折叠 破坏蛋白分子的二 三级结构 而强还原剂 如巯基乙醇 二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂 在样品和凝 胶中加入还原剂和 SDS 后 分子被解聚成多肽链 解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋白 SDS 胶束 所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量 这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异 SDS PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统 于连续缓冲系统相比 能 够有较高的分辨率 浓缩胶的作用是有堆积作用 凝胶浓度较小 孔径较大 把较稀的样 品加在浓缩胶上 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带 当样品液和浓缩胶选 TRIS HCL 缓冲液 电极液选 TRIS 甘氨酸 电泳开始 后 HCL 解离成氯离子 甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子 蛋白质带负 电荷 因此一起向正极移动 其中氯离子最快 甘氨酸根离子最慢 蛋白 居中 电泳开始时氯离子泳动率最大 超过蛋白 因此在后面形成低电导 区 而电场强度与低电导区成反比 因而产生较高的电场强度 使蛋白和 甘氨酸根离子迅速移动 形成以稳定的界面 使蛋白聚集在移动界面附近 浓缩成一中间层 此鉴定方法中 蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量 而与 所带电荷和分子形状无关 具体实验内容具体实验内容 一 实验目的一 实验目的 1 提取鸡蛋清中的溶菌酶 2 测定蛋白质浓度 3 测定溶菌酶的酶活力 二 实验仪器及材料二 实验仪器及材料 1 仪器 柱层析系统 层析柱 恒流泵 紫外监测仪 部分收集器 Sigma 高速冷冻离心机 722s 分光光度计 透析袋 水浴锅 电泳仪 电泳槽 紫外 凝胶成像系统 移液枪 1000ml 200ml 100ml 烧杯 玻璃棒 容量瓶 移液 管 洗耳球 2 材料 新鲜鸡蛋 3 试剂 1 弱酸性阳离子交换树脂 2 磷酸氢二钠 3 磷酸二氢钠 4 氯 化钠 5 硫酸铵 6 氢氧化钠 7 甘油 8 盐酸 9 葡聚糖凝 胶 G 50 10 溶壁微球菌干粉 11 考马斯亮蓝 G 250 12 95 乙醇 13 85 磷酸 14 牛血清清蛋白 BSA 15 脲 16 丙烯酰胺 Acr 17 甲叉双丙烯酰胺 Bis 18 四甲基乙二胺 TEMED 19 甘氨酸 Gly 20 过硫酸铵 AP 21 考马斯亮蓝 R 250 22 三 羟甲基氨基甲烷 Tris 23 2 巯基乙醇 24 十二烷基磺酸钠 SDS 25 溴酚蓝 26 冰醋酸 27 标准蛋白 SDS 低相对分子质 量标准蛋白 4 试剂配制 1 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 2 0 5mol L NaOH 200ml 3 0 5mol L HCl 200ml 4 含 50 甘油的 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH 7 0 200ml 现配 5 含 0 05mol L NaCl 的磷酸盐缓冲液 pH7 0 现配 6 含 0 5 mol L NaCl 的磷酸盐缓冲液 pH7 0 现配 7 含 0 1 mol L NaCl 的磷酸盐缓冲液 pH7 0 现配 8 测活缓冲液 含 30mmol L NaCl 的 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 现配 9 底物溶液 40mg 溶壁微球菌干粉溶于 100mL 测活缓冲液中 现配 公用 10 考马斯亮蓝 G 250 试剂 考马斯亮蓝 G 250 100mg 溶于 50mL 95 乙醇中 加入 100mL 85 磷酸 用蒸馏水稀释至 1000mL 滤纸过滤 公 用 11 标准蛋白质溶液 用 0 1mol L NaCl 的 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 配制 1mg ml 牛血清清蛋白溶液 公用 12 底物溶液 300mg 溶壁微球菌干粉溶于 100ml 测活缓冲液中 生物技术班不用配制 13 10mol L 脲 测活缓冲液配制 生物技术班不用配制 14 30 胶贮液 每 100mL 中含丙烯酰胺 29 2g 甲叉双丙烯酰胺 0 8g 15 1 5mol L Tris HCl pH 8 8 购买 不用配 16 0 5mol L Tris HCl pH 6 8 购买 不用配 17 10 W V 过硫酸铵 现配 18 SDS 电泳缓冲液 25mmol L Tris 0 192mol L Gly 0 1 W V SDS 19 10 W V SDS 公用 20 染色液 0 2g 考马斯亮蓝 R 250 42mL 工业酒精 10mL 冰醋酸 加蒸馏水至 50mL 21 脱色液 5mL 冰醋酸 45mL 工业酒精 50mL 蒸馏水 100ml 22 保存液 7 冰醋酸 现配 23 2 上样缓冲液 购买 不用配 0 5mol L Tris HCl pH 6 8 2mL 甘油 2mL 20 SDS 2mL 0 1 溴酚蓝 0 5mL 2 巯基乙醇 0 5mL 蒸馏水 2 5mL 三 实验步骤三 实验步骤 1 酶的提取酶的提取 一 样品的制备 一 样品的制备 新鲜鸡蛋四个 破蛋壳取出蛋清 加入蛋清体积 1 5 倍的 0 1mol L 磷酸盐 缓冲液 pH 7 0 搅拌均匀 并调 pH7 0 NaOH 调 pH 然后用八层纱布过 滤 留取上清液 量取体积并记录 留 0 4mL 上清液 定为 步骤样品 并 加入 0 4mL 甘油 20 冻存备用 二 阳离子交换层析 二 阳离子交换层析 1 阳离子交换柱的再生 20g 阳离子交换树脂用 0 5mol L NaOH 浸泡 30min 水洗至中性 再用 0 5mol L 盐酸浸泡 30min 水洗至中性 2 平衡 在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂用 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 平衡 3 吸附 在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品 搅拌吸附 1h 玻 璃棒搅拌 4 洗涤 倒去其余上清液 树脂用 100mL 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 洗涤 3 遍 5 装柱 将树脂搅拌均匀装入离子交换柱 再用 300mL 含 0 05mol L NaCl 的 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 洗涤杂蛋白 装柱前 先检查层析柱是否 干净 保证所有接头密闭 管道通畅 装柱时 流速不超过 3mL min 全过 程绝对不能出现流干现象 6 洗脱 用 300mL 含 0 5mol L NaCl 的 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 以 3mL min 的流速进行洗脱 合并光吸收高峰管 量取体积并记录 留 0 4mL 上清液并加入 0 4mL 甘油 20 冻存备用 定为 步骤样品 三 硫酸铵沉淀 三 硫酸铵沉淀 每 100mL 上清液中缓慢加入 35g 硫酸铵固体 溶解后静置 30min 10000rpm 离心 10min 沉淀用 0 5mL 左右含 0 1mol L NaCl 的磷酸盐 缓冲液 pH7 0 溶解 留 0 05mL 上清液并加入 0 05mL 甘油 20 冻存备用 定为 步骤样品 四 注意事项 1 上样前 层析柱要达到平衡 2 上样后要控制流速 四 实验数据 四 实验数据 图 1 酶提取仪器稳定图 图 2 酶提取平衡图 图三 酶提取洗脱图 2 酶的纯化酶的纯化 2 1 分子筛层析分子筛层析 1 溶胀 取葡聚糖凝胶 G 50 3g 加 60mL 蒸馏水沸水浴中煮沸 2h 充分 溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒 如此反复洗涤 2 3 次 最后 加入等体积含 0 1mol L NaCl 的 pH7 0 磷酸缓冲液备用 2 装柱 将凝胶悬浮液搅拌均匀后一次连续性倾入柱中 控制流速 15mL h 自然沉降 注意 绝对不能出现 流干 现象 不能有气泡和分 层 胶面一定要平整 3 平衡 用含 0 1mol L NaCl 的 pH7 0 磷酸缓冲液平衡两个柱体积 控制流 速 15mL h 4 上样 将溶解后的硫酸铵沉淀样品 10000rpm 离心 3min 后上样 当样 品进入胶面后 再用平衡缓冲液约 0 5mL 洗管壁和胶面 3 次 注意 绝对不 能出现 流干 现象和破坏胶面的平整性 5 洗脱 用含 0 1mol L NaCl 的 pH7 0 磷酸缓冲液洗脱 控制流速 15mL h 自动部分收集器收集 2mL 管 紫外监测仪检测洗脱峰或比色法 测定洗脱峰 合并光吸收及酶活高峰管 2 2 透析浓缩 用含 50 甘油的 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH4 0 透析浓缩 4h 20 分装 保存备用 定为 步骤样品 2 3 实验图谱 图 4 酶纯化稳定图 图 5 酶纯化峰值图 2 4 注意事项 1 层析柱上方要留有少量液体 避免使凝胶暴露于空气中 2 凝胶过滤上样时 使样品沿管壁缓缓流下 勿冲破胶面 3 酶活力 蛋白浓度测定酶活力 蛋白浓度测定 3 1 蛋白浓度的测定 1 标准曲线的制定 取 14 支试管 按下表分两组进行平行操作 管号0123456 标准蛋白 质溶液 ml 00 010 020 030 040 050 06 缓冲液0 100 090 080 070 060 050 04 考马斯亮 蓝 G 250 5ml 摇匀 1h 内以 0 号试管为空白对照 在 595nm 处比色 A595nm00 0510 0890 1190 1690 2050 235 绘制标准曲线 以 A595nm为纵坐标 标准蛋白含量为横坐标 绘制标准曲线 图 6 蛋白质测定标准曲线图 2 测定未知样品蛋白质浓度 管号 吸光度0 1180 0560 0730 610 稀释倍数101010010 蛋白浓度 0 28460 12581 69330 01546 2 酶活力测定 管 号12 测活缓冲液 ml2 53 0 底物溶液 ml2 52 5 酶液 ml0 50 在室温 以 1 号管为对照 每隔 30s 测定 2 号 595nm 处的光吸收值 时间样品号0s30s60s90s120s150s180s 0 0170 1070 1350 1700 1870 2100 224 0 1240 1420 1670 1950 2130 2350 254 0 1310 1560 1810 2070 2260 2380 253 A595nm 0 2570 3280 3480 3500 3570 3660 370 四 注意事项 酶活测定和蛋白定量实验中所用试管 刻度吸管要干燥 量取试剂要准确 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对 分子量及纯度鉴定分子量及纯度鉴定 1 配制 15 的分离胶 1 用胶框封好玻璃板后架好胶板 2 按如下比例配好分离胶 混合后立即加入到电泳槽两玻璃板之间到上口约 2cm 止 再加约 1ml 蒸馏水水封 聚合后将水吸干 蒸馏 水 1 5mol L Tris HCl pH8 8 胶贮 液 10 SDSTEMED10 AP 4 7mL5mL10mL200uL10uL100uL 2 配制 4 的浓缩胶 蒸馏 水 0 5mol L Tris HCl pH6 8 胶贮 液 10 SDSTEMED10 AP 6 1mL2 5mL1 3mL100uL10uL50uL 混合后立即加到分离胶上 加入梳子 聚合后装好电泳缓冲液后小心拔出梳 子 3 样品制备 样品与 2 上样缓冲液 1 1 混匀 并在 100 水浴中保温 3 5min 取出待用 4 上样 电泳 将样品和标准蛋白加到样品孔中 加样量每孔 10uL 加好后开始电泳 先恒 压 80V 样品进入分离胶后恒压 120V 直到溴酚蓝走至距前沿 1cm 为止 5 染色 电泳完毕 剥胶前先将凝胶在前沿处作一标记区别正反面后再将凝胶浸泡于 染色液中染色 2h 6 脱色 用脱色液脱至区带清晰为止 五 实验结果 观察电泳后各种蛋白质和染料前沿的迁移距离 用相对迁移率 Rf 样品迁移 距离 染料迁移距离 对 lgM 作图 根据酶样品的相对迁移率 求出酶的相对 分子质量 并对电泳结果照相保存 六 注意事项 1 Acr 和 Bis 均为神经毒剂 对皮肤有刺激作用 操作时应戴手套和口罩 纯 化应在通风橱内进行 2 玻璃板表面应光滑洁净 否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气 泡 3 样品槽模板梳齿应平整光滑 4 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡 以免影响电泳时电流的通过 5 切勿破坏加样凹槽底部的平整 以免电泳后