正交试验报告

主讲人：汪雁佳,“救命仙草石斛,ShihuDENDROBII CAULIS,石斛简介,我石斛属兰科石斛属多年生草本植物，全世界约有1400 种，其中铁皮石斛(Dendrobium candidumWal.l exLind.l )是我国常见的石斛品种之一。 铁皮石斛具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖和降血脂等多种功效，现代药理学研究表明，石斛多糖是石斛中的主要功能成分。,产地：主产于广西、贵州、广东、云南、四川等省区。,制剂开发,目前市场上已研制开发出了铁皮枫斗、铁皮石斛冲剂（颗粒）、铁皮石斛饮料、铁皮石斛微粉、铁皮石斛酒、铁皮石斛茶、复方天人百合铁皮石斛 、复方鲜石斛胶囊、复方鲜石斛片、复方鲜石斛丸、纳米石斛明目制剂药物、鲜石斛晶、纳米石斛夜光制剂药物、铁皮石斛复方制剂等系列保健产品。 更多的产品有待于进一步的研究与开发。,前景分析,从目前的市场看，特级纯正铁皮枫斗价格在每公斤十万元左右。一级枫斗价格在每公斤二到三万元，且有价无货，其产量只有需求量的0.004% ，可谓一克难求。预计在10年内铁皮石斛的产量仍难以满足市场的需求。（供不应求） 据全国中资源普察统计，目前，整个石斛市场年需求总量在800010000吨，且以每年10%15%的需求递增。而人工种植刚刚起步，再加上其产品的开发商家逐年增加，导致几乎已无法获取到其成品进行加工，所以许多企业处于半停产或待料生产状态。,国内石斛研究热点分析,铁皮石斛原球茎多糖提取最佳工艺研究超声法提取铁皮石斛多糖工艺的研究正交试验优选铁皮石斛类原球茎多糖的提取纯化工艺石斛中石斛多糖的提取工艺研究棒节石斛中的多糖分布及提取工艺研究超声波辅助提取金钗石斛多糖工艺优化研究基于正交试验法的铁皮石斛原球茎生长和多糖合成研究闪式提取铁皮石斛多糖,热点分析 （一）,石斛多糖提取工艺,稀土微肥对铁皮石斛试管苗壮苗的影响铁皮石斛原球茎液体悬浮培养的研究霍山石斛原球茎液体培养条件的优化大苞鞘石斛胚组织培养及植株再生研究金钗石斛类原球茎诱导及增殖的正交试验3种石斛兰以茎段为外植体的离体快繁技术霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化春石斛离体培养条件优化及其试管开花研究金属离子对霍山石斛类原球茎增殖及植株 再生的影响,不同激素浓度对铁皮石斛高效快繁体系的影响正交试验优选环草石斛不同氮磷钾营养水平对铁皮石斛组培苗生长的影响大苞鞘石斛组织培养快繁研究不同因素对大苞鞘石斛原球茎分化的影响金钗石斛原生质体的制备与融合铁皮石斛组培苗生根条件优化研究石斛ISSR-PCR体系的优化春石斛和铁皮石斛试管苗壮苗生根条件的优化石斛明目胶囊药材水煎醇沉工艺的正交试验,热点分析 （二）,石斛快繁技术,石斛多糖提取工艺优化,石斛多糖含量的市场调查,赵立，阚(kn)永军，庞文生等按照 2015 版中国药典铁皮石斛项下多糖及甘露糖含量测定方法，随机检测了目前市售铁皮石斛的质量，结果显示不同产地铁皮石斛多糖含量在 34% 42% 之间，甘露糖含量在 19% 27% 之间。市售铁皮石斛含量差别较大，这可能与其品种、产地、采收期及种植年限有关，但其含量均符合药典规定范围( 总多糖含量不低于 25%，甘露糖含量在 13% 37% 之间) ，可作为铁皮石斛药材入药。,赵立等. (2017). 市售铁皮石斛多糖及甘露糖含量比较研究. 海峡药学, 29(7), 29-31.李彩霞, & 竹剑平. (2010). 不同采收期铁皮石斛中多糖含量比较. 药物分析杂志(6), 1138-1139.,多糖质量分数,考查指标及方法,多糖得率=提取得到的多糖质量/原料质量100%多糖含量：,多糖含量 = 总糖 - 还原糖。,石斛多糖含量的测定方法：苯酚硫酸法 苯酚制取:取苯酚200g，加铝片O.2g和碳酸氢钠O.1g，蒸馏，收集182摄氏度馏分，称取一定量重蒸苯酚，加入蒸馏水混匀，溶解即得。置棕色瓶中，放冰箱内备用。,不同提取方法对石斛多糖含量测定的影响,方法：分别采用回流提取、改进回流提取、超声波提取与超声辅助热回流提取法对石斛多糖进行提取，通过苯酚- 硫酸法检测其多糖含量。结果：4种提取方法所测得的多糖含量分别为（13.4730.634）、（15.6920.743）、（11.870.536）、（16.290.407）。结论：采用超声辅助热回流提取法所得含量最高，而且提取时间短、提取较为彻底，该方法比较技术先进，提取效率较高，优于水提法，提取过程中能量消耗大，成本相对较高。,罗傲雪, 范益军, 罗傲霜. (2010). 不同提取方法对石斛多糖含量测定的影响. 中国药房, 21(7), 601-602.,多糖工艺流程,热水法回流提取多糖工艺流程： 原料称重回流去杂质热水浸提过滤滤液浓缩80乙醇（45倍）沉淀过滤烘干复溶Sevage法除蛋白（多糖粗品的纯化过程）醇沉烘干铁皮石斛类原球茎多糖。影响因素： 加水量、水温、浸提时间、提取次数优缺点：是传统的多糖的提取方法，成本低，取材方便，提取条件易于控制，经济适用，操作方法相对简单但是繁杂，重复提取次数较多，提取时间过长，提取效率相对较低。,试验材料和仪器,试验材料 悬浮培养于1/2MS液体培养基的铁皮石解原球茎，于60度烘干后，经粉碎、干燥恒重处理后备用。试剂 氯仿、苯酚、浓硫酸、正丁醇、乙醇、葡萄糖、冰醋酸、胃蛋白酶、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白均为分析纯。仪器 UV-1700型分光光度计、索氏提取器、HH-S恒温水浴涡、ZFQ85A旋转蒸发仪、SHZ-200型双配套循环水式多用真空泵、冷冻干燥机。,采用L8(24)正交设计，试验重复2次，各处理内容见表1。,多糖提取条件的确立,何铁光, 杨丽涛, 李扬瑞等. (2006). 铁皮石斛原球茎多糖提取最佳工艺研究. 西北农业学报, 15(5), 240-243.,次数较少,时间,提取次数,温度,加水量,整体含量小,结果分析：影响响大小顺序是:提取次数溶剂用量提取温度提取时间，各因素的最佳水平为A1B2C1D2。,2h,4h,1次,3次,80,100,10倍,20倍,根据多糖性能，选用水煎煮工艺，选择提取时的加水量、提取时间、提取次数、药材粉碎度4个试验因素，每个因素3个水平进行优选,采用L9(34)表对石斛进行石斛多糖的提取和测定，并作为考察指标。因素水平表见表1。,钱叶, & 吕不望. (2005). 石斛中石斛多糖的提取工艺研究. 中国现代应用药学, 22(4), 293-294.,结果分析：影响石斛多糖含量的因素依次为粉碎度提取次数加水量提取时间。最佳提取条件为A1B3C3D3,但根据计算，A因素2，3水平间几乎在同一数量级，从省时节能，降低成本的角度考虑，选择A2B1C2D3，即石斛中石斛多糖的最佳提取条件为将药材粉碎至粗粉，加水20倍量,提取3次,每次4h。,4h,6h,8h,10倍,20倍,30倍,2次,3次,4次,饮片,小段,粗粉,多糖粗品的纯化,原理：石斛多糖粗品中含有蛋白质,为进一步纯化多糖粗品需经脱蛋白处理。常用Sevage法即将多糖粗品的水溶液与氯仿和正丁醇混合,使蛋白质变性成为不溶性聚集在氯仿和水的界面上,经离心后可将蛋白质去除。,粗多糖脱蛋白时,样品/氯仿+正丁醇(v/v)为1B0.35,氯仿/正丁醇(v/v)为1B0.4,反应时间以5 min最佳。,Sevage法脱蛋白的正交试验：,除去蛋白质采用Sevage方法，按L4(23)正交设计,试验重复2次。另外,采用蛋白酶法Sevage法交替数次脱蛋白。以样品溶液与Sevage试剂体积比（A）、氯仿与正丁醇体积比（B）、反应时间（C）为考察因素。,粗多糖脱蛋白时,样品/氯仿+正丁醇(v/v)为1：0.35,氯仿/正丁醇(v/v)为1：0.4,反应时间以5 min最佳。,总结,通过正交试验对铁皮石斛原球茎多的提取和蛋白质的去除条件进行优化选择,可以使分离多糖产品的生产达到多糖含量高、生产效率高、资源利用高的多糖产品。经醇析得到的多糖产品可直接应用于饮料、食品中，用Sevage法进一步纯化后可用于医药、保健品中。,赵立, 阚永军, 庞文生, & 胡娟. (2017). 市售铁皮石斛多糖及甘露糖含量比较研究. 海峡药学, 29(7), 29-31.刘静平, 朱先红, & 贾景明. (2011). 正交试验优选铁皮石斛类原球茎多糖的提取纯化工艺. 中国药房, 22(15), 1378-1380.尚喜雨. (2010). 水提法酶法提取铁皮石斛多糖的比较研究. 安徽农业科学, 38(18), 9787-9788.李娇, 荣永海, & 荣龙