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NextGenerationSequencing NGS 技术简介 Sanger测序 Sanger测序法仍然为基因测序行业内的金标准 但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈 价格昂贵 步骤繁琐 效率低 NGS NextGenerationSequencing NGS也称为高通量测序High throughputSequencing HTS 第一代测序 SangerSequencing Sanger测序 第二代测序 NGS MassivelyParallelSequencing 大规模平行测序 第三代测序 NGS HTS SingleMoleculeSequencing 高通量 单分子测序 目前NGS的主要三种测序仪器 三种测序仪在高通量水平 测序准确度 存储格式和技术方法上均有差异 三大测序平台的技术特点和差异 Roche454测序原理 Roche454焦磷酸测序原理 Roche454测序步骤 样品处理主要是针对大片段的DNA分子 如基因组DNA Fosmid或BAC质粒等 利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化 然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化 选择500 800bp的DNA片段 对于非编码RNA或PCR产物 则不需要这一步骤 一 样品处理 Roche454测序步骤 二 文库制备 文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步 454的文库接头分A B两种 各44bp 由20bp的PCR引物 20bp的测序引物及4bp TCAG 的 key 碱基构成 其中B接头的5 端带有生物素 Biotin 标记 用于磁珠纯化步骤 Roche454测序步骤 三 连接微珠 将富集到的文库与测序磁珠 各反应物混合 加入特定的矿物油和表面活性剂 再利用振荡器剧烈振荡 使反应体系形成油包水 water in oil 的稳定乳浊液 在理想条件下 每一个液滴 或称微反应器 microreactor 中将只包含一个磁珠和一条单链DNA 通过控制条件 1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器 Roche454测序步骤 四 emRCR PCR扩增后 每一个磁珠上将形成密集的DNA簇 这些DNA序列完全相同 即可用于后续的步骤 乳液PCR emRCR Roche454测序步骤 五 反应板准备 上机测序 454测序的反应板称为PTP PicoTiterPlate 含有350万个由光纤组成的小孔 每个孔的直径为29 m 而测序磁珠的直径为20 m 因此每个孔中仅能容纳一个磁珠 Roche454测序步骤 六 测序和分析 将磁珠与测序试剂加入PTP中 使之可用于上机测序 在454测序仪中 A T G C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的 每步反应四种碱基依次加入反应池 当碱基配对结合 就会释放出一个焦磷酸 PPi 而这个焦磷酸在酶的作用下 将荧光素氧化成氧化荧光素 并发出光信号 从而读取出这一位置的碱基信息 Illumina测序原理 Illumina合成测序原理 Illumina测序流程 桥式PCR 合成法测序 数据读取 ABISOLiD测序原理 ABISOLiD连接测序原理 ABISOLiD测序流程 制备DNA文库乳液PCR 微珠富集连接酶测序 SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物 连接反应中 这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对 这样经过五轮测序反应后便可以得到所有的碱基序列SOLID的双碱基编码矩阵 ABISOLiD连接测序原理 探针的5 末端标记了1种颜色的荧光染料 探针3 端1 5位为随机碱基 其中第1 2位构成的碱基对表征探针染料类型 而3 5位的 n 为随机碱基 6 8位的 z 是可以和任何碱基配对的特殊碱基 SOLiD测序反应的每一轮测序反应会连接第1 5位的碱基 同时切除第6 8位的碱基 同时记录下第1 2位碱基决定的荧光颜色 ABISOLiD连接测序原理 ABISOLiD连接测序原理 两个碱基共同决定一个颜色 可以极大的提高测序的准确率 ABISOLiD连接测序原理 五轮测序反应反应后 按照第0 1位 第1 2位 的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来 就得到由 0 1 2 3 组成的SOLiD原始颜色序列 454平台的突出优势是读长 目前454系统的序列读长已超过400bp 虽然454平台的测序成本比其他平台要高很多 不过对于那些需要长读长的应用 如从头拼接和环境微生物组学 它仍是最理想的选择 各个测序平台的特点总结 Roche454 Illumina 1 可扩展的超高通量GenomeAnalyzer系统目前每次运行后可获得超过20GB的高品质过滤数据 经优化后通量还有望上升到95GB 相当于人类基因组的30倍覆盖度 2 需要样品量少GenomeAnalyzer系统需要的样品量低至100ng 能应用在很多样品有限的实验 比如免疫沉淀 显微切割等 中 3 简单 快速 自动化GenomeAnalyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程 制备样品文库可以在几小时内完成 一个星期内就能得到高精确度的数据 自动化的流程不减少了手工操作误差和污染可能性 也不需要机器人操作或洁净室 1 无以伦比的通量目前SOLiD3系统单次运行能产生50GB的人基因组序列数据 相当于基因组的17倍覆盖度 这显然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的2 准确性 新的超精确检测模块 ECC模块 将提供高达99 99 的精确性 多达98 的可定位碱基的质量值高于45 更多标签以提高灵敏度和动态范围 高准确性的原始读序 支持无参考序列的数据分析 各个测序平台的特点总结 ABISOLiD 第三代测序平台的比较差异 太平洋生物科学公司 PacBio s 实时单分子测序方案示意图 A 单个零点启动模式波导纳米结构的侧面图 每个纳米结构含一个DNA聚合酶分子 固定于底部的玻璃面上 波导纳米结构和共焦成像系统确保只对底部进行荧光检测 B 显示了荧光标记的核苷酸底物掺入测序模板的过程 相应的瞬时荧光探测分为5个步骤 太平洋生物科学公司 LifeTechnology公司 IonTorrent半导体测序芯片技术图示 A 该芯片结构设计的逐层显示图 上层为单个的DNA聚合反应的微池 底部两层构成场效应晶体管离子传感器 每个微池有其相对应的场效应晶体管探头 以鉴别每一个pH值的变化 B 侧面图 微池中 DNA聚合酶将两个重复的TTP核苷酸掺入测序片段中 反应过程中释放出的氢离子被下方的场效应晶体管检测到 CompleteGenomics公司 CompleteGenomics公司的DNB阵列生产和cPAL技术的方案示意图 A