第五章人类疾病动物模型.ppt

第五章人类疾病动物模型 现代生物学家眼中的生命 个体水平 细胞水平 分子水平 蛋白质 DNA DNA RNA Protein CCTGAGCCAACTATTGATGAA CCUGAGCCAACUAUUGAUGAA CCUGAGCCAACUAUUGAUGAA PEPTIDE 动物个体水平的研究手段 利用各种疾病动物模型进行人类疾病比较学的研究 找出人类疾病发生发展的规律及预防和治疗的方法 为了保证这些动物实验更科学 准确和重复性好 用各种方法把一些需要研究的生理或病理活动 相对稳定地显现在实验动物身上 供实验研究之用 这就称之为动物实验中的动物模型 动物模型的优越性 一 避免了在人身上进行实验所带来的风险临床上对外伤 中毒 肿痛病因等研究是有一定困难的 甚至是不可能的 如急性和慢性呼吸系统疾病研究中很难重复环境污染的作用 辐射对机体的损伤也不可能在人身上反复实验 而动物可以作为人类的替难者 在人为设计的实验条件下可反复观察和研究 因此 应用动物模型 除了能克服在人类研究中经常会遇到的理论和社会限制外 还容许采用某些不能应用于人类的方法学途径 甚至为了研究需要可以损伤动物组织 器官或处死动物 二 临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来如放射病 毒气中毒 烈性传染病 可以根据研究目的要求随时采用实验性诱发的方法在动物身上复制出来 三 可以克服人类某些疾病潜伏期长 病程长和发病率低的缺点一般遗传性 免疫性 代谢性和内分泌等疾病在临床上发病率很低 研究人员可以有意识地提高其在动物种群的中发生频率 从而推进研究 如肿瘤 这些疾病发生发展很缓慢 有的可能要几年 十几年 甚至几十年 有些致病因素需要隔代或者几代才能显示出来 人类的寿命期相对来说是很长的 但一个科学家很难有幸进行三代以上的观察 而许多动物由于生命的周期很短 在实验室观察几十代是容易的 四 可以严格控制实验条件 增强实验材料的可比性一般说来 临床上很多疾病是十分复杂的 各种因素均起作用 因病人的年龄 性别 体质 遗传等各不相同 对疾病的发生发展均有影响 采用动物来复制疾病模型 可以选择相同品种 品系 性别 年龄 体重 活动性 健康状态 甚至遗传和微生物等方面严加控制的各种等级的标准实验动物 用单一的病因作用复制成各种疾病 温度 湿度 光照 噪音 饲料等实验条件也可以严格控制 无论营养学 肿瘤学和环境卫生学等方面 同一时期内很难在人身上取得一定数量的定性疾病材料 动物模型不仅在群体的数量上容易得到满足 而且可以通过投服一定剂量的药物或移植一定数量的肿瘤等方式 限定可变性 取得条件一致的模型材料 五 可以简化实验操作和样品收集动物模型作为人类疾病的 缩影 便于研究者按实验目的需要随时采取各种样品 甚至及时处死动物收集样本 这在临床是难以办到的 实验动物向小型化的发展趋势更有利于实验者的日常管理和实验操作 六 有助于更全面地认识疾病的本质临床研究未免带有一定的局限性 已知很多疾病除人以外也能引起多种动物感染 其表现可能各有特点 通过对人畜共患病的比较研究 可以充分认识同一疾病的病原体 或病因 对不同机体带来的各种损害 因此从某种意义上说 可以使研究工作上升到立体的水平来揭示某种疾病的本质 从而更有利于解释在人体上所发生的一切病理变化 因此 利用动物疾病模型来研究人类疾病 对理解疾病发生 发展至关重要 对基因在体功能的分析 疾病发病机制的探讨 药物新靶点的发现及临床前药效学评价等研究具有十分重要的科学意义和临床意义 产生新学科 比较医学 比较医学是研究实验动物与人类的基本生命现象 对不同物种的疾病发生和发展进行比较 以求得疾病的立体全息图像 从而了解人类疾病的发生 发展规律 提高人类疾病的诊断和治疗水平 促进病理 生理 药理 毒理和新药创制的研究 OnemedicineOnehealth 比较医学研究的内容 一是比较不同动物对同一病原或病因所引起的反应 综合成多维的 全息图像 寻找接近人类疾病的最大公约数的动物模型 人类疾病动物模型二是对人类疾病特定替代模型的实验数据进行诠释 界定特定疾病模型和人类疾病在组织病理 细胞和分子机制方面的相似性 开展实验动物模型的可控研究 力求阐明特定模型在人类疾病研究中的适应范围 动物模型的建立和动物实验结果的诠释成为比较医学的研究核心 动物模型的优劣 应能很好地再现所要研究的人类疾病 即动物疾病应与人类疾病类似 不同的人 在不同的时间和地点 都应能稳定地复制出相同的动物模型 动物的背景资料完整 动物合格 生命周期要满足实验需要 动物易于获得 来源充足 运送方便 复制的方法应有一定的特异性 而且复制率高 若复制率不高 模型价值不高 若用一种方法能复制多种模型 则无专一致 也降低了模型的价值 一 人类疾病动物模型的设计原则 1 相似性2 重复性3 可靠性4 适用性和可控性5 易行性和经济性 相似性 在动物身上复制人类疾病模型 目的在于从中找出可以推广 外推 应用于病人的有关规律 设计动物疾病模型的一个重要原则是 所复制的模型应尽可能近似于人类疾病的情况 能够找到与人类疾病相同的动物自发性疾病当然最好 例如SHR就是研究人类原发性高血压的理想模型 老母猪自发性冠状动脉粥样硬化是研究人类冠心病的理想模型 自发性狗类风湿性关节炎与人类幼年型类风湿性关节炎十分相似 也是一种理想模型等等 与人类完全相同的动物自发性疾病模型毕竟不可多得 往往需要人工加以复制 为了尽量做到与人类疾病相似 首先要注意动物的选择 例如 小鸡最适宜做高脂血症的模型 因它的血浆甘油三酯 胆固醇以及游离脂肪酸水平与人十分相似 低密度和极低密度脂蛋白的脂质构成也与人相似 如果动物模型与临床情况不相似 在动物身上有效的治疗方案就不一定能用于临床 反之也然 例如 动物内毒性休克 单纯给动物静脉输入细菌及其毒素所致的休克 与临床感染性 脓毒性 休克就不完全一样 因此对动物内毒素性休克有效的疗法长期以来不能被临床医生所采用 重复性 理想的动物模型应该是可重复的 甚至是可以标准化的 例如用一次定量放血法可百分之百造成出血性休克 百分之百死亡 这就符合可重复性和达到了标准化要求 增强动物模型复制时的重复性必须注意动物品种 品系 年龄 性别 体重 健康情况 饲养管理 实验及环境条件 季节 昼夜节律 应激 室温 湿度 气压 消毒灭菌 可靠性 复制的动物模型应该力求可靠地反映人类疾病 即可特异地 可靠地反映某种疾病或某种机能 代谢 结构变化 应具备该种疾病的主要症状和体征 经化验或X光照片 心电图 病理切片等证实 例如铅中毒可用大鼠做模型 但有缺点 因为它本身容易患地方性肺炎及进行性肾病 后者容易与铅中毒所致的肾病相混淆 不易确定该肾病是铅中毒所致还是它本身的疾病所致 用蒙古沙土鼠就比较容易确定 因为一般只有铅中毒才会使它出现相应的肾病变 适用性和可控性 供医学实验研究用的动物模型 在复制时 应尽量考虑到今后临床应用和便于控制其疾病的发展 以利于研究的开展 如雌激素能终止大鼠和小鼠的早期妊娠 但不能终止人的妊娠 因此 选用雌激素复制大鼠和小鼠终止早期妊娠的模型是不适用的 因为在大鼠和小鼠筛选带有雌激素活性的药物时 常常会发现这些药物能终止妊娠 似乎可能是有效的避孕药 但一旦用于人则并不成功 所以 如果知道一个化合物具有雌激素活性 用这个化合物在大鼠或小鼠观察终止妊娠的作用是没有意义的 有的动物对某致病因子特别敏感 极易死亡 也不适用 如狗腹腔注射粪便滤液引起腹膜炎很快死亡 80 24小时内死亡 来不及做实验治疗观察 而且粪便剂量及细菌菌株不好控制 因此不能准确重复实验结果 又如选用大小鼠作实验性腹膜炎就不适用 因为它们对革兰氏阴性细菌具有较高的抵抗力 很不容易造成腹膜炎 易行性和经济性 在复制动物模型时 所采用的方法应尽量做到容易执行和合乎经济原则 灵长类动物与人最近相似 复制的疾病模型相似性好 但灵长类动物稀少昂贵 即使猕猴也不可多得 更不用说猩猩 长臂猿 很多小动物如大小鼠 地鼠 豚鼠等也可以复制出十分近似的人类疾病模型 它们容易作到遗传背景明确 体内微生物可加控制 模型显著且稳定 年龄 性别 体重等可任意选择 而且价谦易得 便于饲养管理 因此可尽量采用除非不得已或一些特殊疾病 如痢疾 脊髓灰白质炎等 研究需要外 尽量不用灵长类动物 除了在动物选择上要考虑易行性和经济性原则外 而且在模型复制的方法上 指标的观察上也都要注意这一原则 二 动物模型分类 一 按产生原因分类1 诱发性动物模型 experimentalanimalmodel 又称为实验性动物模型 指通过使用物理 化学 生物等致病手段 人为制造的疾病模型 优点 制作方法简便 实验条件比较简单 其他因素容易控制 短时间内可大量复制 缺点 诱发的疾病模型与自然产生的疾病在某些方面有所不同 而且有些人类疾病不能用人工方法诱发出来 物理因素诱发 如手术致骨折 放射线致免疫抑制化学因素诱发 如高油脂饲料致兔动脉粥样硬化 化学毒物中毒生物因素诱发 如微生物感染复合因素诱发 如豚鼠慢支用致病菌加寒冷或加SO2生物技术制作的动物模型 如嵌合体动物 转基因动物 克隆动物等 2 自发性动物模型 spontaneousanimalmodel 指不加任何人工诱发 在自然条件下动物自然产生的疾病 或者由于基因突变的异常表现 通过遗传育种保留下来的动物疾病模型 以肿瘤遗传性疾病居多 优点 在一定程度上减少了人为的因素 更接近自然的人类疾病 缺点 种类有限 疾病动物饲养条件要求高 发病率低 发病时间长 自发肿瘤模型因动物种系 品种不同 其肿瘤所发生的类型和发病机制有差异 自发性动物模型应用价值很高 特别是在遗传性疾病 免疫缺陷病 肿瘤等的研究上得到了广泛应用 近几十年来科学界十分重视自发性动物模型的开发 如与人类心脏病相似的加拿大犬 与儿童碳水化合物 氨基酸代谢失调相似的猫 自发性高血压和脑中风大鼠 青光眼兔 自发性糖尿病地鼠 肥胖症小鼠 裸鼠等等 3 抗疾病型动物模型 negativeanimalmodel 是指特定的疾病不会在某种动物身上发生 因此可借以探讨为何该种动物对该疾病有天然的抵抗力 如哺乳类动物均感染血吸虫病 而洞庭湖流域的东方田鼠却不能复制血吸虫病 故可用于血吸虫感染和抗病的研究 4 生物医学动物模型 biomedicalanimalmodel 是指利用健康正常的动物生物学特征来提供人类疾病相似表现的疾病模型 如沙鼠缺乏完整的脑基底Willis动脉环 动脉环后交通支 可用来结扎一侧颈动脉制备脑梗塞 脑缺血模型鹿的正常红细胞是镰刀形的 多年来一直用于镰刀形红细胞贫血研究 二 按系统范围分类 各系统疾病动物模型指与人类各系统疾病相应的动物模型如神经 大鼠囊状脑动脉瘤 心血管 小型猪动脉粥样硬化 呼吸 豚鼠慢支 消化 轮状病毒性肠炎 内分泌与代谢 糖尿病 泌尿等等 三 疾病基本病理过程的动物模型 指各种疾病共同性的一些病理变化过程模型 如发热 炎症 休克 电解质紊乱等 四 按中医药体系分 中医动物模型是根据中医理论 对人类疾病原型的某些特征进行模拟复制 创造出的人工疾病和证的实验动物 中医动物模型的建立 其造模方法的选择至关重要 造模方法大致可归纳为如下三种类型 模拟中医传统病因建立动物模型 纯 中医病证动物模型一般不与现代医学疾病模型相等 造模方法有单因素和复合因素两种单因素造模 如根据中医 恐伤肾 原理 采用猫吓孕鼠法 得到子代先天肾虚模型 用耗气破气理论 以中药 大黄 厚朴 枳实 灌喂大鼠 塑造脾气虚动物模型复合因素造模 用中医先天不足和后天失养的病因 复制仔兔体弱易感动物模型 采用西医病因病理复制动物模型 此种模型多是在特定的化学 生物 机械和物理的致病因素作用下 复制出西医或中医病名的动物模型 或再用中药或中医疗法观察疗效及监测病理改变 其在造模时重视动物组织 器官或全身的病理损害 这是目前应用最广泛的一种实验形式 依据中西医结合病因学说塑造动物模型 造模方法是既运用了中医的发病学说 又考虑了西医的致病原理 实际上是综合了上述两种类型的造模特点而塑造的动物模型目前应用较少 五 按模型对象分 整体动物模型离体组织器官模型细胞株模型数学模型 三 影响动物模型的因素 1 致模因素2 动物因素3 实验技术因素4 环境和营养因素 1 致模因素 病毒因素药物因素物理因素基因因素 2 动物因素 1 相似性原则结构功能的相似性时象或年龄的相似性群体分布的相似性生态或健康状况的相似性疾病特点的相似性操作实感的相似性 2 特殊性原则3 标准化原则4 规格化原则年龄体重性别5 经济性原则6 重视动物福利 3R原则 不能盲目地使用近交系动物 自发性糖尿病大鼠 BB Wistar 除具有糖尿病临床特征外 还发现多种病理变化 外周神经系统严重病变 睾丸萎缩 甲状腺炎 胃溃疡 恶性淋巴瘤等 因此要有目的地选择 动物形成亚系后不应该再视为同一品系 要充分了解新品系的特征和背景材料 即使作为已形成模型的品系 由于不适当的育种方法和环境改变 还可发生新的基因突变和遗传漂变 即存在着变种甚至断种的危险 国外经常用杂交一代 F1 作为模型 其个体之间均一性好 对实验的耐受性强 又多少克服了近交系的缺点 但盲目引进F1代动物 对复制所要求的模型是缺乏意义的 进化程度并不意味着所有器官和功能接近于人 复制动物模型时 在条件允许的情况下 应尽量考虑选用与人相似 进化程度高的动物作模型 但不能因此就认为进化程度越高等的动物其所有器官和功能越接近于人 非人灵长类诱发动脉粥样硬化时 病变部位经常在小动脉 即使出现在大动脉也与人类分布不同 据报导用鸽作这类模型时 胸主动脉出现的黄斑面积可达10 镜下变化与人也比较相似 因此也广泛被研究者使用 不同类型的动物种群的优点和缺点 实验室种群 不同类型的动物种群的优点和缺点 家养动物种群 不同类型的动物种群的优点和缺点 野生动物种群 3 实验技术因素 复制过程中固定 出血 麻醉 手术 药物和并发症等处理不当 会产生难以估量的恶果 因此 要求尽可能使模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中 4 环境和营养因素 复制模型的成败往往与环境的改变有密切关系 拥挤 饮食改变 过度光照 噪音 屏障系统的破坏等 任何一项被忽视都可能给模型动物带来严重影响 论文中动物实验的描述 品种 品系的名称微生物质量来源合格证号性别 年龄体重数量实验和饲养环境动物实验处理方式 正确地评估动物疾病模型 表面效度结构效度预测效度 综合评价 表面效度 指现象的相似性例如 抑郁症动物模型动物的情绪表现类似于人类相应的情绪表现 测量的指标中应包括相应的情绪障碍 结构效度 动物模型建立在一个合理的构想上 即动物模型应该和人类疾病具有相似的原因 行为反应和共同的生物学机制 预测效度 模型对于相应病理障碍有效的经典药物的反应性和选择性 反应性灵敏 选择性强的动物模型预测效度高 模型结论的相对性 应该懂得没有一种动物模型能完全复制人类疾病真实情况 动物毕竟不是人体的缩影 模型实验只是一种间接性研究 只可能在一个局部或几个方面与人类疾病相似 因此 模型实验结论的正确性只是相对的 最终必须在人体身上得到验证 复制过程中一旦出现与人类疾病不同的情况 必须分析其分岐范围和程度 找到相平行的共同点 正确评估哪些是有价值的 动物实验技术 实验动物的固定 标记实验动物的给药途径和采血方法实验动物用药量的确定及计算方法实验动物的麻醉和处死方法 常用药物的最大给药量 人及不同实验动物之间药物量对应值 例如 某药物在60kg体重的病人的剂量为21 0 g kg 1 d 1 一只5kg的猴为53 6 g kg 1 d 1 一只10kg重的犬为40 4 g kg 1 d 1 一只20g的小鼠则为260 6 g kg 1 d 1 实验动物的血样采取 一 小 大鼠剪尾采血此法每鼠可采10次以上 小鼠每次0 1ml 大鼠每次0 4ml 眼眶后静脉丛采血小鼠每次0 2 0 3ml 大鼠每次0 5ml 股动脉采血小鼠每次0 5ml 大鼠每次2 0ml 二 豚鼠耳缘切口采血 0 5ml 心脏采血 足背正中静脉采血 三 家兔耳缘静脉采血 5 10ml 耳中动脉采血 15ml 心脏采血 20 25ml 四 犬前肢皮下头静脉和后肢外侧小隐静脉采血 10 20ml 颈静脉采血 心脏采血 常用实验动物的最大安全采血量与最小致死采血量 常用麻醉剂的用法及剂量 动物模型的鉴定内容 一 表现型鉴定与分析 二 遗传型鉴定与分析 一 表现型鉴定与分析 临床症状与体征被毛应整洁 有光泽 有被毛自洁能力 体温 脉搏 呼吸数变动在一个较为恒定的范围之内 一般说来 发热的程度可反映疾病的程度 范围及其性质 1 最高热 提示某些严重的急性传染病 2 高热 可见于急性感染性病与广泛性的炎症 3 中等热 通常见于消化道 呼吸道的一般性炎症及某些亚急性 慢性传染病 4 微热 仅于局限性的炎症及轻微的病程见到 几种不同的发热类型 1 稽留热 高热持续数天或更长时期 且每昼夜的温差很小为其特点 此乃致热物质在血液中长期存在并对中枢给予不断刺激的结果 2 弛张热 昼夜间有较大的升降变动为其特点 多见于许多化脓性疾病及败血症以及非典型经过的某些传染病 3 间隔热 在持续数天的发热后 出现无热期 如此以一定间隔期间而反复交替出现发热的现象 通常是由有毒物质周期性的进入血液而导致 体格 发育状况 体格 发育状况一般可以根据骨骼与肌肉的发育程度来确定应用测定器测定其体高 体长 体重等数值体格发育良好的动物 其结构均称 肌肉结实 被毛整齐 相反 发育不良的动物 多表现为躯体瘦小 结构不匀称 特别是幼年动物 常呈发育迟缓甚至发育停滞 这种情况一般可提示营养不良或患慢性和遗传性疾病 动物的营养状况 通常可根据肌肉的丰满度 特别是皮下脂肪的普积度而判断 被毛的状态和光泽 也可做为营养状况的参考 营养程度标志着机体物质代谢的总趋势在表型分析上 将肌肉丰满 皮下脂肪充盈 躯体圆满为营养良好骨骼表露明显等多为营养不良 营养不良是许多动物疾病临床常见症状 高度的营养不良 称为恶病质 是表型分析中判断预后不良的一个重要指标 行为学 正常时中枢神经系统的兴奋与抑制两个过程保持动态平衡 动物表现为静止时较安静 行动时较灵活 经常注意外界 对各种刺激较为敏感 当中枢神经机能发生障碍时 兴奋与抑制过程的平衡被破坏 临床上表现为过度兴奋或抑制 兴奋是中枢机能亢进的结果 轻则惊恐 不安 重则狂燥不驯 处于兴奋的动物易惊 对外界的轻微刺激表现强烈的反应 动物经常表现为不安 旋转 惊恐 啃咬物体 甚至攻击 咬 人 抑制是中枢神经机能紊乱的另一表现 轻则表现沉郁 重则嗜睡 甚至呈现为昏迷状态 共济失调往往多为疾病侵害小脑或遗传性小脑发育障碍的标志 临床表现为在运动中动物四肢配合不协调 呈醉酒状 行走不稳 摇摆 步态似涉水样 盲目运动可提示为脑膜的充血 出血 炎症或某些影响脑的传染病和寄生虫病 盲目运动表现为无目的地徘徊 直向前冲 后退不止 绕柱打转或呈圆圈运动 有时以一肢做轴而呈现钟样运动 当然 当动物出现中枢神经系统先天性病变也会有这些表型出现 病理学 疾病是一个极其复杂的过程 在病原因子和机体反应功能的相互作用下 患病机体有关部分的形态结构 代谢和功能都会发生种种改变 这是研究和认识疾病的重要依据 病理学的研究手段已远远超越了传统的经典的形态观察 而采用了许多新方法 新技术 从而使研究工作得到了进一步的深化 但形态学方法 包括改进了的形态学方法 仍不失为基本的研究方法 大体观察 主要运用肉眼或辅之以放大镜 量尺 各种衡器等辅助工具 对检材及其病变性状 大小 形状 色泽 重量 表面及切面状态 病灶特征及坚度等 进行细致的观察和检测 这种方法简便易行 有经验研究的工作者往往能通过大体观察而确定或大致确定诊断或病变性质 如肿瘤的良恶性等 组织学观察 将病变组织制成厚约数微米的切片 经不同方法染色后用显微镜观察其细微病变 从而千百倍地提高了肉眼观察的分辨能力 加深了对疾病和病变的认识 是最常用的观察 研究疾病的手段之一 同时 由于各种疾病和病变往往本身具有一定程度的组织形态特征 故常可借助组织学观察来诊断疾病 如活检 细胞学观察 运用采集器采集病变部位脱落的细胞 或用空针穿刺吸取病变部位的组织 细胞 或由体腔积液中分离所含病变细胞 制成细胞学涂片 作显微镜检查 了解其病变特征 此法常用于某些肿瘤和其他疾病的早期诊断 但限于取材的局限性和准确性 有时使诊断难免受到一定的限制 近年来在影像技术及内窥镜等指引下进行细针穿刺吸取组织 细胞进行检查 穿刺活检 既提高了穿刺的安全性 也提高了诊断的准确性 总之 对动物表型分析应采用各种技术和方法 综合分析和判断 表型组学 Phenomics 是将生物体的表现型特征视为一个整体 表型组 进行研究的领域 生物体的表型特征大都是由基因组与环境相互作用产生的 表现型鉴定与分析的标准化操作程序 SOPs 所谓SOPs 是将操作过程用书面的形式记录下来 形成语言简洁 明确的指令性书面文件 使其操作有章可循 作到标准化 规范化 它使实验操作更具体 更详细 更易于掌握 是实验方法技术和注意事项等多方面的指南 规范标准化的表现型数据 有利于应用计算机来推导基因型 表型关系 有利于利用生物信息学方法 开发先进的表型信息数据库 SHIRPA表型筛选方案是目前国际通用的表现型分析标准化操作程序 它由几十项标准化简单测试与记录所组成 包括生理生化 组织病理 糖脂类代谢 心血管形态和功能 肿瘤学 动物行为学及免疫学检测方法及相关技术标准 尽最大可能在相同的环境条件下获得具有可比性的表型数据 例如 肿瘤标准化技术指标 动物遗传模型的繁育与肿瘤发生的观测 监测与记录 动物肿瘤模型的形态学 解剖学与一般病理学检验与研究 动物肿瘤模型的血液学检验与研究 动物肿瘤模型的细胞生物学检验与研究 动物肿瘤成像分析与检测与研究 动物肿瘤的特定免疫组织化学检测与研究 动物肿瘤的分子生物学与基因组学检测与研究 动物肿瘤转移的特定研究 二 遗传型鉴定与分析 1 孟德尔遗传学分析2 生物信息学 比较基因组与蛋白质组学分析 1 孟德尔遗传学分析 受一对等位基因控制的自发遗传性动物疾病 其传递方式称为单基因遗传又称为孟德尔式遗传 按致病基因所在染色体的不同 单基因遗传分为常染色体遗传和性连锁遗传两类 按致病基因在世代中传递的特点 单基因遗传又分为显性遗传和隐性遗传两种 1 染色体显性遗传 致病基因P位于常染色体上 且对其等位基因P呈显性 这种动物模型的传递方式称为常染色体显性遗传 显性遗传的特征 1 缺陷或疾病代代相传 2 除产生新的突变外 患病后代的双亲中至少有一个患有同样的遗传病 3 患病双亲的正常后代与正常动物交配所产生的后代均不发病 4 缺陷与疾病的传递与性别无关 模型动物中雄性与雌性之比约为1 1 5 患病的子代全部患病 表明双亲中至少有一个是致病基因纯合个体 如有75 子代患病 表明双亲均为致病基因杂合个体 如有50 子代患病 表明双亲之一是致病基因杂合个体 6 如果遗传病由显性致死基因引起 则其发生概率很小 等于突变率的两倍 显性遗传的特殊形式 1 不规则显性遗传 某些显性致病基因在杂合子中受到某种遗传背景 如存在修饰基因 和环境因素的影响 有时表现出显性而发病 有时不表明显性而不发病 这种传递方式称为不规则显性遗传 它的表现程度用外显率表示 所谓外显率是指一定基因型个体在特定环境中形成相应表型的比例 用百分率表示 不规则显性遗传就是显性致病基因的外显率造成的 这种遗传病通常可以隔代相传 显性遗传的特殊形式 2 半显性遗传致病基因的纯合个体与杂合个体的病情有明显差别 纯合个体病情严重 往往以死亡告终 杂合个体病情轻微 遗传病的这种传递方式称为半显性遗传或不完全显性遗传 这种动物绝大多数是杂合个体 其子代的50 是患病动物 25 是正常动物 25 死亡 显性遗传的特殊形式 3 共显性遗传等位基因之间不存在显性与隐性关系 杂合个体中两种基因的作用都能得以表现 但又不呈半显性遗传 这种等位基因称为共显性等位基因或等显性等位基因 它们的传递方式称为共显性遗传 如血型 白细胞抗原等 显性遗传的特殊形式 4 不同表现度的显性遗传在显性遗传性动物疾病模型中 具有同样基因型的不同个体虽然都有该病的病理情况 但其严重程度都有所不同 这是因为显性遗传病模型还存在着不同的表现度 2 常染色体隐性遗传 致病基因a位于常染色体上 且对其等位基因A呈隐性 因而只有纯合个体 aa 才表现出特定的病理性状 遗传病的这种传递方式称为常染色体隐性遗传 在杂合个体Aa中 由于存在正常的显性基因A 致使隐性致病基因a的作用不能表达而不发病 遮掩的杂合个体表现为健康的动物 但能将致病基因传递给下一代 故称之为携带者当携带者与正常动物交配时 其子代均为表型正常 但其中有50 携带者 携带者之间交配产生的子代有25 是致病基因纯合个体 50 携带者 25 正常动物 病理特征显现的个体与表型正常的个体之比为1 3 隐性遗传的特征 1 缺陷式疾病往往隔代传递 2 双亲皆为病患动物时 其子代也会全部是病患动物 3 缺陷时疾病的传递与性别无关 患病动物中雄性与雌性之比约为1 1 隐性遗传的特征 4 如果缺陷时疾病发生率很低 则有以下几种情况 之一 大多数患病动物是表型正常的携带者 携带者之间交配时 其子代的发病风险为25 之二 携带者与正常纯合体交配时 其子代有50 携带者 携带者雄性动物与其雌性子代交配或携带者子代间相互交配时 发病风险为12 5 之三 患病动物与正常动物交配 如产生的子代与患病动物 则该正常动物必定是携带者 发病风险为50 之四 近亲交配时 其子代发病风险明显提高 性连锁遗传 致病基因位于性染色体上 随性染色体传递的疾病 其传递方式称为性连锁遗传 又称为伴性遗传 按致病基因的性质和性染色体的种类 性连锁遗传可分为X连锁显性遗传 X连锁隐性遗传和Y连锁遗传3种 X连锁显性遗传 致病基因H位于X染色体上 且对其等位基因呈显性 由它控制的疾病随X染色体传递 这种遗传病中 雌性动物两条X染色体中任何一条上存在致病基因都会发病 雄性动物只有一条X染色体 存在致病基因也可发病 但其发病概率只有雌性动物的50 X连锁显性遗传特征 1 疾病代代相传 2 疾病的发生与性别有关 雌性动物的发病率约为雄性动物的2倍 3 患病雄性的子代中只有雌性发病 雄性全部是正常 4 患病雌性动物的子代可能全部发病 雌性是纯合个体 或 雌性是杂合子 5 除发生新的突变外 患病动物的双亲中必定有一个是患病动物 X连锁隐性遗传 致病基因a位于X染色体上 且对等位基因A呈隐性 由它控制的病理性状随X染色体传递 但在雌性动物中只有致病基因的纯合个体 XaXa 发病 杂合个体 XaX 为携带者 在雄性动物中只有一条X染色体 当存在一个隐性致病基因a时 由于没有相应的等位基因掩盖a的作用 所以也表达病理性状或遗传缺陷 遗传病的这种传递方式称为X连锁隐性遗传 存在一个X连锁致病基因a的雄性动物称为半合子 在X连锁隐性遗传时 雄性动物的致病基因只能从其母亲中传来 以后也只能传递给子代中的雌性动物 故又将这种传递方式称为交叉遗传 X连锁隐性遗传特征 1 缺陷式疾病隔代相传 2 缺陷式疾病的发生与性别有关 在群体中雄性的发病率明显高于雌性 3 双亲患病动物 其子代全部都是患病动物 4 两个表型正常的亲代交配所产生的子代中 如果出现患病动物是雄性 其致病基因由携带致病基因的母亲传递 5 缺陷式疾病呈典型的交叉遗传 具有以下几种情况 之一 患病雄性动物与无亲缘关系的雌性动物交叉时 所有子代均为表型正常 但其儿女全部是携带者 之二 患病雌性动物与正常雄性动物交配时 其子代中的雄性全部发病 雌性为表型正常的携带者 之三 表型正常的两个双亲交配所产生的子代中 雌性的发病风险为零 雄性的为50 性连锁遗传的特殊形式 限性遗传的某些致病基因控制的病理性状只能在一个性别 雄性或雌性 中表现出来 例如 犬的隐睾症是受常染色体隐性致病基因控制的 它只能在雄性动物中表达出来 生物信息 比较基因组学分析 生物信息学技术通过互联网和一系列计算机软件 对已知的各种生物信息 例如核酸和蛋白质序列 进行分析 比较和归纳 以揭示生命的特征 因此 生物信息学的基础就是各类生物信息数据库 比较基因组学的研究表明 哺乳类动物的基因组是相当保守的 这不但为人们了解哺乳类动物的基因组进化及机制创造了条件 而且由于基因组的保守性为人们用较低级的动物来研究人类的遗传性疾病或基因组异常疾病提供了实验材料 例如大鼠具有高血压 关节炎 糖尿病 肾病 肿瘤以及突发心脏病等人类疾病模型 其中有一种称之为Goto Kakizaki品系的大鼠 具有非胰岛素依赖型糖尿病 NIDDM 的典型特征 是人类相应疾病的良好模型 通过研究人们发现在这种大鼠个体中有三个基因座并证实参与了葡萄糖代谢 通过它们找到另外两个影响体重的基因座 通过对人类与大鼠之间比较基因组和数量性状基因座 QTL 的研究 研究人员大胆地预测在人类中有26个染色体区域 可能存在类似的基因 拓展研究表明在小鼠也有类似染色体区域 此外 在对与人类生活环境相似的狗的研究中发现 狗中有215种遗传性疾病与人类疾病非常相似 至今被证实已有41种是由人类同样的基因引起 四 动物模型的制作举例 感染动物模型慢病毒引起的疾病 病程很慢 都有神经系统退行性症状 脑部出现淀粉样沉淀 形成海绵状空斑 对这类疾病的研究 以羊搔痒病为代表 困难很大 发病率低 病程慢 传染病 遗传病不清楚 病因 病原物找不到人们只能猜想 有一种 慢病毒 在起作用 1 从发病动物分出纯培养 2 再接种到健康动物 引起同样疾病 3 再分离出纯培养 应和接种的培养基具相同特性 证实病源物的柯赫法则 普列昂的发现 以改进检测方法为突破点目标 分离 纯化病原物 并加以鉴定 每一步都离不开检测方法 第一个进步 把搔痒病从羊转至小鼠发病潜伏期3 5年4 5个月 第二个进步 检测方法终点滴度检测法 用小鼠作实验材料接种给小鼠150天鼠脑中病原物的滴度最高分离纯化步骤15 30天再接种给小鼠4 5个月出现病症 潜伏期检测法 用仓鼠作实验材料终点滴度检测法潜伏期检测法 例行的检测 改进后的检测方法 方法 12个月70天60只小鼠4只仓鼠总共加快速度100倍 得到难以公布的实验结果原来预期得到小型病毒 结果 所有实验数据都表明 病原物不是小型病毒 不含核酸 而是蛋白质粒子 经过八年努力 1974 1982 1982年发表第一篇文章 提出羊搔痒病病原物是一种蛋白质粒子 蛋白质类的感染颗粒 ProteinoceousInfectiousParticle Prion 普列昂概念的提出 引起轩然大波 许多人问 没有核酸 这个病原物如何增殖 如何复制本身的遗传信息 许多人怀疑 可能还是存在核酸 只是未能检测出来 具有讽刺意味的是 最早提出实验证据 证明核酸是遗传信息载体的是Avery1942年有关肺炎球菌转化因子的实验 当时 Avery的报告未能引起多大重视 有人怀疑转化因子中起作用的是蛋白质 只是Avery未能检测出来 关键在于普利昂是否含有核酸 普鲁西纳回忆说 在寻找核酸上 D Riesuer和我所花的功夫比其他任何人都多 更深入的研究 更意外的结果随着研究的深入 得到更多打破传统观念的结果 1 寻找Prn p基因编码普列昂蛋白 PrP 的基因 不但在染病动物脑中存在 亦在正常动物脑中找到 而且表达得一样多 PrPsc PrPc 看来 PrP蛋白不是病鼠才有 而且 PrPsc的出现不是调节基因起作用的结果 正常小鼠 得病小鼠 分别把Prn p基因在正常和染病小鼠中的表达产物称为 普列昂蛋白 PrPc 在正常动物脑中的功能是什么 找不到答案 剔除PrP基因的遗传工程小鼠 PrP 看不出病症 似乎一切正常 亦能正常生育 PrP 小鼠作出贡献把染病小鼠的脑提取物接种给PrP 小鼠 后者不染病 同样的脑提取物 接种给普通小鼠PrP 后者被染病 染病小鼠 脑提取物 看来 PrPc的存在是染病的必要前提 PrP 小鼠 PrP 小鼠 对PrPc和PrPsc两种蛋白质做结构分析 结果 都是由208个氨基酸残基组成的疏水性很强糖蛋白 氨基酸序列RNA剪辑翻译后修饰 均无差别 最后 终于找到差别PrPc和PrPsc在高级结构上有巨大差别PrPcPrPsc 螺旋40 21 折叠3 54 PrPcPrPc 上 PrPsc 下 PrPc和PrPsc在高级结构上的差别 在细胞内的行为和代谢特征上也反映出来 PrPcPrPsc胞内定位细胞表面胞质内蛋白酶水解水解完全局部水解 综合上面得到的结果 提出一个理论设想 搔痒病的发生是因为PrPsc的入侵 把脑细胞中原来就有的PrPc 带坏 使PrPc重新折叠 形成新的高级结构 变成了PrPsc 增多的PrPsc形成淀粉样斑 造成脑细胞破坏 出现空斑 b 接着 初始和新形成的搔痒病粒子就攻击另外的两个正常的PrP分子 细胞质 核 搔痒病PrP 正常PrP 原有的PrP分子 转化了的PrP分子 a 搔痒病PrP的一个分子 红色 和正常的PrP分子 褐色 相接触并以某种方式展开而形成搔痒病构型 c 后者反过来又去攻击其他正常分子 以此方式连续进行下去直至搔痒病PrP积累到危害量 什么叫PrPsc把PrPc 带坏 实际上是 蛋白质大分子与蛋白质大分子之间的相互作用 生物大分子之间的相互作用还包括蛋白质 核酸之间的相互作用 动脉粥样硬化发病机理和动物模型 一 脂质浸润学说本病的主要病理变化是动脉壁出现楼板样斑块 而胆固醇和胆固醇酯则是构成粥样斑块的主要成分 虽然动脉壁也能合成胆固醇和其他脂质 但近年来对动脉壁和内皮细胞的生理和病理研究以及对粥样硬化病变的组织化学和免疫化学检查的结果 证实粥样斑块中的脂质主要来自血浆 血浆中的胆固醇 甘油三酯和磷脂等是与载脂蛋白结合成脂蛋白而溶解 运转的 故本病与脂质代谢失常密切相关 其本质是动脉壁对从血浆侵入的脂质的反应 二 血栓形成和血小板聚集学说前者认为本病开始于局部凝血机制亢进 动脉内膜表面血栓形成 以后血栓被增生的内皮细胞所覆盖而并入动脉壁 血栓中的血小板和白细胞崩解而释出脂质和其他活性物质 逐渐形成粥样斑块 三 损伤反应学说认为粥样斑块的形成是动脉对内膜损伤的反应 动脉内膜损伤可表现为内膜功能紊乱如内膜渗透增加 表面容易形成血栓 也可表现为内膜的完整性受到破坏 长期高脂血症 由于血压增高 动脉分支的特定角度和走向 血管局部狭窄等引起的血流动力学改变所产生的湍流 剪切应力 以及由于糖尿病 吸烟和血管活性物质如儿茶酚胺 血管紧张素等的长期反复作用 都足以损伤内膜或引起功能变化 有利于脂质的沉积和血小板的粘附和聚集 而形成粥样硬化 四 单克隆学说认为动脉粥样硬化的每一个病灶都来源于一个单一平滑肌细胞的增殖 这个细胞是以后增生成许多细胞的始祖 在一些因子如血小板源生长因子 内皮细胞源生长因子 单核细胞源生长因子 LDL 可能还有病毒的作用下不断增殖并吞噬脂质 因而类似于良性肿瘤 并形成动脉粥样硬化 五 其他与发病有关的其他机理尚有神经 内分泌的变化 动脉壁酶活性的降低等 这些情况可通过影响血管运动 脂质代谢 血管壁的合成代谢等而有利于粥样硬化病变的形成 五 动物模型的制作举例 动脉粥样硬化动物模型 动脉粥样硬化动物模型制作过程 猪模型5 6月龄 分为实验组和对照组 单笼饲养 对照组只给基础饲料 实验组在少量基础饲料中拌入10 蛋黄粉和1 2 胆固醇 根据体重变化情况调整饲料量 为使动脉粥样硬化模型更接近人的病变 可采用间接饲养法 于第17周停喂胆固醇和蛋黄粉4周 到第21周再恢复 并不再调整饲料量 直至第29周 相关指标检测 病理形态学检查肉眼光镜电镜免疫组织化学检查生化检查血清总胆固醇甘油三酯低密度脂蛋白高密度脂蛋白载脂蛋白A 载脂蛋白B等 高血压动物模型 急性实验性高血压模型常选用狗 猫 大鼠 家兔和猴 猴来源不易 家兔血压升高不够显著 故后两种动物较少应用 复制的方法很多 如直接刺激中枢神经系统 通过神经反射 外源性儿茶酚胺类或其它体液加压物质注射等 这类模型造成的高血压时间短 不适于长时间的研究 复制慢性实验性高血压模型 除遗传性高血压动物模型较能模拟人类高血压病的自然过程外 其它各类慢性实验性高血压动物模型 如神经原型 肾型 内分泌型和饮食型等 大多要经过一定的手术 药物或其他附加因素处理 与人类高血压病的临床不完全一致 但是对于筛选有效降压药仍然是十分重要的实验手段 听源性高血压 采用大鼠与家鼠杂交生的大灰鼠 比纯种大鼠较易诱发成功 4月龄 放入隔音室内笼养 噪音刺激可由电铃或扬声器发出 发音器是一个音频振荡器 连接一个20W高音扬声器 噪音刺激应经常在700 1000周 秒中变换 噪音刺激每30秒一次 亦可每隔1分钟刺激30秒 可随时变换毋须恒定 但噪音干扰须日夜不止 连续数月 噪音刺激连续3个月后血压普遍升高 大灰鼠正常平均收缩压为113 8mmHg 此时可升高到130 140mmHg 有40 动物收缩压可高达160mmHg 此种高血压动物模型与人的高血压病相类似 适用于降药物的筛选 实验性肾动脉狭窄性高血压 将狗或家兔麻醉后 暴露肾并小心地钝性分离出一段肾动脉 选用一定直径的银夹或银环套在肾动脉上造成肾动脉狭窄 如一侧肾动脉狭窄 则应将另一侧肾摘除 在间隔10 12天后进行 手术后几天 血压开始升高 1 3月后血压升达高峰 并可长期维持下去 例如家兔手术前血压平均值为100mmHg 手术后2周升到125mmHg 1个月后升到135mmHg 2个月后可升达140 194mmHg 血压升高速度和程度取决于肾动脉狭窄的程度 当肾动脉过度狭窄时 会造成恶性高血压 并使动物迅速死亡 一般狭窄血管口经的1 4 1 3为宜 此种肾型高血压模型与临床高血压病的改变相同 对降压药效果也与临床病人相等 肾外包扎高血压 肾外异物包扎 可致肾周围炎 在肾外形成一层纤维素性鞘膜 压迫肾实质 造成肾组织缺血 使肾素形成增加 血压上升 选用120 150g大鼠 小心地将肾脏与周围组织剥离 将自制的双层乳胶薄膜剪成 X 形 绕肾门将肾脏交叉包扎 然后在相对侧切开 取出右肾 分离后切除 分别缝合肌肉和皮肤创口 术后可加饮1 氯化钠溶液作为促进因素 约经20天 有70 以上的大鼠出现高血压 收缩压一般可升高50 以上 艾滋病动物模型 艾滋病 AIDS 是由人免疫缺陷病毒 HIV 引起 以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病 是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一 艾滋病在1985年传入我国 截至2006年10月31日 全国历年累计报告艾滋病183733例 其中艾滋病病人40667例 死亡12464例 艾滋病已成为全球关注的公共卫生和社会热点问题 艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一 AIDS动物模型应具备6个条件 能感染HIV 动物体型小 它的遗传 免疫和代谢等已研究得比较清楚 靶细胞应该是CD4 T淋巴细胞和巨噬细胞为主 靶器官应包括血液 淋巴组织和脑 传染方式应类似HIV 有短暂的潜伏期 发病症状与人AIDS相似 利用动物中同类病毒感染相同宿主动物 如小鼠白血病病毒感染小鼠 猫免疫缺陷病毒 FIV 感染猫 猴逆转录病毒 SRV 和猴免疫缺陷病毒 SIV 感染实验用猴 结果发现猴免疫缺陷病毒 SIV 感染实验用猴的模型效果比较理想 表现为和AIDS的临床表征 发病过程 免疫缺陷特征等非常相似 加之HIV和SIV有一定的基因同源性 人和猴的生物学特性也较其他动物接近 因而 SIV SAIDS 猴艾滋病 模型被广泛接受和应用 艾滋病SIV SAIDS动物模型的制备 艾滋病的三种传播途径分别是经血液 性和母婴传播 性传播包括同性传播和异性传播两种方式 SIV动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值 最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病 包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型 根据上述主要的自然感染方式 以SIVmac251接种中国恒河猴 可以制备四种不同感染途径的动物模型 血液感染模型 通过静脉等途径 病毒直接感染到血液中的CD4 T淋巴细胞 如用1mL2 105TCID50的SIVmac251经静脉缓慢推入猴体内可感染中国恒河猴 成功率非常高 异性性传播模型 通过阴道粘膜上皮途径感染 病毒可能直接感染郎格汉斯细胞 上皮细胞 在灵长类动物AIDS模型的研究中发现体内注入黄体酮可促进SIV传播 而雌激素则抑制SIV传播 可能与这些激素能影响阴道壁厚度或通过IL 2等影响CCR5和CXCR4受体表达有关 在合适的生理周期或使用一定量的黄体酮的情况下 用导尿管将1mL2 107TCID50的SIVmac251缓慢注入猴阴道内 可建立异性性传播动物模型 同性性传播模型 通过直肠粘膜上皮途径感染 病毒直接感染M细胞 上皮细胞 直肠的生理构造及上皮细胞厚度非常薄等特点 都使直肠感染较阴道感染容易发生 同性恋者易患艾滋病的另一原因 可能因为同性恋者经常使用吸入亚硝酸盐作为性刺激剂 而亚硝酸盐是一种免疫抑制剂 使同性恋者免疫力异常 艾滋病毒易侵入而发病 在建立此类模型时 可以考虑用亚硝酸盐等作为免疫抑制剂 研究这些制剂的作用 用1mL2 107TCID50的SIVmac251缓慢注入猴直肠内 可建立同性性传播动物模型 母婴传播模型 近年来 用SIV接种新生恒河猴建立了新生儿AIDS动物模型 观察到了与HIV感染的婴儿相似的症状 如果使用毒力强的SIV毒株 新生恒河猴的疾病进程进展非常快 该模型在研究婴儿感染HIV的疾病特征和治疗方面有实用价值 有学者发现过猴艾滋病的母猴 生产的小猴患有艾滋病 这是最理想的母婴传播动物模型 但由于不易得到 使使用受到限制 注意 病毒经静脉 阴道和直肠途径感染的效应细胞不同 静脉接种是直接感染CD4 T细胞 阴道中是感染郎格汉斯细胞 上皮细胞 直肠是M细胞 上皮细胞 直肠和阴道粘膜的构造也不相同 阴道主要是鳞状上皮细胞 直肠主要是柱状上皮细胞 而且上皮细胞的厚度也存在很大差异 阴道上皮细胞的厚度是直肠上皮细胞的十几倍 病毒在不同的感染途径 受到来自机体的免疫压力也不尽相同 因而 不同的感染途径在临床表现 病毒学指标以及其他方面存在一定的影响 艾滋病SIV SAIDS动物模指标和结果 临床表现为 实验猴在感染后7 14天出现食欲减退 并持续两周以上时间 体重有所下降 腹股沟等处浅表淋巴结可触及肿大 感染后半年时 感染猴出现明显食欲减退 体重下降 腹泻 腹股沟淋巴结变小 体表多处感染红肿 动物因耗竭而死亡 以经脉感染为甚 由于动物个体差异不同 疾病的程度和临床过程 表现不尽相同 有时AIDS症状不十分典型 病毒分离结果 一般感染后7天 在三种途径实验猴全血中均能分离到病毒 病毒分离高峰出现在感染后10天到40天左右 以后全血病毒滴度迅速下降 维持低水平状态 血浆病毒载量的检测可发现感染后三种途径变化趋势基本一致 感染后迅速上升 在14天左右可达到107以上 维持40天左右 以后迅速下降 一般静脉感染猴病毒检出阳性较早 其次为直肠感染猴 最后是阴道感染猴 急性期过后 猴的病毒载量出现一定的波动 P27抗原检测在急性期很容易检测到 CD4 CD8 比值在实验猴感染后7天开始下降 并出现倒置 这种现象可持续较长时间 在整个