内毒素凝胶法检查技术.ppt

凝胶法BET检查技术 2009年3月 2020 3 27 Http Page2 1 凝胶法BET试验程序2 试验器具3 鲎试剂灵敏度复核4 干扰初筛试验5 干扰试验6 检查法7 实验相关知识及技巧 2020 3 27 Http Page3 1 凝胶法BET的实验程序 试验准备确定供试品的内毒素限值选择鲎试剂计算最大有效稀释倍数或最低有效浓度鲎试剂灵敏度复核干扰初筛试验干扰试验日常检查 2020 3 27 Http Page4 2 试验器具 试验器具的要求及处理玻璃器皿需经除热原处理 以除去可能存在的外源性内毒素 常用方法是玻璃器皿经清洗后在 250 至少干烤1小时塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具 2020 3 27 Http Page5 孵育反应仪器恒温水浴箱干式恒温仪 2020 3 27 Http Page6 孵育反应温度是鲎试验的重要条件参数之一现行法规对反应温度的要求较宽松 37 1 严格的实验条件是实验室水平的重要标志之一80年代发达国家已使用干式恒温仪取代水浴箱2000年版 中国药典 BET法开始接受干式恒温仪 TAL 40型试管恒温仪的特点温控精确 37 0 2 发热均匀 0 1 可定时及提示 0 90分钟任意可设定时 到时蜂鸣提示试管免封口 无水蒸气或水滴影响体积小巧 使用方便 2020 3 27 Http Page7 3 鲎试剂标示灵敏度的复核试验 实验目的验证实验室的条件是否满足BET实验的要求验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求验证实验所用试剂 包括鲎试剂 内毒素标准品 BET水等 是否满足BET实验的要求 2020 3 27 Http Page8 实验步骤开启恒温仪器预热C溶液 标准内毒素溶液 的制备鲎试剂的准备加样及恒温反应结果判断数据处理 2020 3 27 Http Page9 操作步骤示意图 翻转180度 观察凝胶状况 2020 3 27 Http Page10 灵敏度复核试验举例 试剂 2020 3 27 Http Page11 1 标准内毒素溶液C的制备 0 25EU ml 30s 30s 1EU ml 30s 30s 2 0ml 100EU ml 0 4ml CSE BET水 1 0ml 10EU ml 0 4ml 3 6ml 0 5EU ml 2 0ml 3 6ml 2 0ml 2 0ml 0 125EU ml 30s 2 0ml 2 0ml 0 06EU ml 30s 2 0ml 2 0ml 混合5分钟 2020 3 27 Http Page12 2 鲎试剂的准备 取0 1ml装量 灵敏度为0 25EU ml的鲎试剂18支 在安瓿颈部折断 按照阴性对照溶液D两支 标准内毒素溶液每浓度平行4管排列 用精确移液器准确吸取0 1mlBET水分别加入每支鲎试剂中 使鲎试剂全部溶解 阴性对照溶液D 0 06EU ml 0 125EU ml 0 25EU ml 0 5EU ml 2020 3 27 Http Page13 3 加样 用精确移液器分别吸取0 1ml的0 5EU ml 0 25EU ml 0 125EU ml 0 06EU ml的标准内毒素溶液C 加入复溶的鲎试剂中 每浓度平行4管 吸取0 1mlBET水 D溶液 加入另外两支鲎试剂内 作为阴性对照 CSE TAL 0 1ml 0 5EU ml 0 1ml 0 1ml 0 25EU ml 0 1ml 0 1ml 0 125EU ml 0 1ml 0 1ml 0 06EU ml 0 1ml 0 1ml BET水 0 1ml 加样顺序一般从低浓度到高浓度 2020 3 27 Http Page14 4 恒温反应 将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀 避免产生气泡 放入37 1 的恒温器中孵育60 2分钟 孵育过程中避免振动影响凝胶形成 若恒温装置是水浴恒温箱 那么在加样后需将反应管封口 避免水蒸气进入反应管内造成污染 2020 3 27 Http Page15 5 结果判断 将反应试管从恒温器中轻轻取出 缓缓倒转180 若管内形成凝胶 并且凝胶不变形 不从管壁滑脱者为阳性 记录为 未形成凝胶或形成的凝胶不坚实 变形并从管壁滑脱者为阴性 记录为 阳性 阴性 结果判断 反应管缓缓倒转180 阳性 凝胶不变形 不从管壁滑脱者阴性 凝胶不能保持完整 从管壁滑脱者试验符合要求的基本条件 NC管全部阴性 2 管全部阳性 0 25 管全部阴性 2020 3 27 Http Page16 6 数据处理举例 c lg 1 X 4 lg 1 0 903 0 602 0 602 0 602 4 0 210EU ml即本批号鲎试剂的复核灵敏度 c 为0 21EU ml药典要求 当 c在0 5 2 包括0 5 和2 时 方可用于细菌内毒素检查 并以标示灵敏度 为该批鲎试剂的灵敏度值 结论 本批TAL的灵敏度标示值符合规定 2020 3 27 Http Page17 4 干扰初筛试验 目的及原理本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验 通过对一系列含2 内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应 初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度本试验可减少干扰试验的盲目性 2020 3 27 Http Page18 试验步骤 供试品限值的确定供试品最大有效稀释倍数的确定试剂的选择反应溶液的制备加样及反应结果判断 2020 3 27 Http Page19 干扰初筛试验举例 1 供试品限值硫酸庆大霉素 100ml 瓶 20000U ml 药典要求 硫酸庆大霉素限值L 0 5EU 1000U 2020 3 27 Http Page20 2 最大有效稀释倍数的确定 最大有效稀释倍数MVD cL 使用 0 5EU ml灵敏度的鲎试剂时 MVD0 5 因此可计算出使用不同 时所对应的MVD 0 5EU ml 20000U ml 0 5EU 1000U 20 倍 2020 3 27 Http Page21 3 试剂 为了方便试验 干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验 2020 3 27 Http Page22 4 各反应溶液的制备 2020 3 27 Http Page23 溶液C的制备 E100 0 4ml 3 6mlW E10 溶液C E2 溶液A的制备 S原液 0 4ml 3 6mlW S10 溶液A 备用液 备用液 2020 3 27 Http Page24 溶液B的制备 溶液B SE2 注意事项 制备溶液C和B时 每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒 2020 3 27 Http Page25 5 加样及反应 开启20支鲎试剂 分别用移液器准确吸取0 1mlBET水将鲎试剂复溶取0 1ml相应溶液C B A加入鲎试剂反应管 每浓度平行2管另外取0 1mlBET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管 2020 3 27 Http Page26 6 结果判断 当溶液A D均为阴性 溶液C均为阳性时 试验有效溶液B系列中 第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度 本试验中的样品无干扰浓度为 S40 2020 3 27 Http Page27 5 干扰试验 通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度 来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰 至少对3批样品进行干扰试验 2020 3 27 Http Page28 试验步骤 供试品限值的确定鲎试剂的选择最大有效稀释倍数的确定反应溶液的制备加样及反应结果判断 2020 3 27 Http Page29 1 供试品限值 硫酸庆大霉素 20000U ml 药典要求内毒素限值L 0 5EU 1000U 2 试剂的选择 根据干扰初筛试验的结果 供试品在40倍稀释 对应鲎试剂灵敏度为0 25EU ml 时无干扰一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验 这里我们选择灵敏度为0 125EU ml的鲎试剂进行干扰验证试验 2020 3 27 Http Page30 3 最大有效稀释倍数的计算 MVD cL 80 倍 4 各反应溶液的制备 2020 3 27 Http Page31 溶液C的制备 CSE E4 E2 E E0 5 E0 25 即E0 5 E0 5 E0 125 E0 06 E0 03 溶液C 混合5分钟 2020 3 27 Http Page32 溶液A的制备 S原液 0 3ml 2 7mlW S10 硫酸庆大霉素 S 0 3ml S10 2 7ml 1 0ml 3 0ml 溶液A S80 BET水 0 6ml 0 6ml S40 2020 3 27 Http Page33 溶液B的制备 2020 3 27 Http Page34 5 加样及反应 开启36支鲎试剂 先分别用0 1mlBET水复溶 再分别加相应的溶液0 1ml A B C和D 37 1 反应60 2分钟 0 25EU ml 2 0 125EU ml 0 06EU ml 0 03EU ml BET水 S80E0 25 SE2 S80E0 125 SE S80E0 06 SE S80E0 03 SE S80 2020 3 27 Http Page35 6 结果判断 反应结果 2020 3 27 Http Page36 结果计算及判断 药典规定 当溶液A和溶液D 阴性对照 的所有平行管都为阴性 且0 5 Es 2 时 试验有效 当0 5Es Et 2Es时 供试品在该浓度下无干扰 本试验 1 0 5 0 06 2 0 25Es 0 125 0 5 Es 2 有效 2 0 5Es 0 06 2Es 0 25Et 0 104 0 5Es Et 2Es 无干扰 结论 使用灵敏度 0 125EU ml的鲎试剂对样品 S 的80倍稀释液 S80 作BET 无干扰 ES lg 1 4 lg0 125 4 0 125EU ml Et lg 1 0 104EU ml lg0 06 lg0 125 3 4 2020 3 27 Http Page37 6 检查法 1 凝胶法限量试验反应项目设置 2020 3 27 Http Page38 试剂 根据干扰试验结果 供试品在80倍稀释 使用鲎试剂灵敏度为0 125EU ml条件下 对BET无干扰本试验选择TAL灵敏度为0 125EU ml 供试品稀释80倍检查 2020 3 27 Http Page39 各反应溶液制备 溶液C 溶液A 溶液B 2020 3 27 Http Page40 加样及反应 开启8支鲎试剂 分别加0 1mlBET水复溶 再分别加入相应的溶液 每浓度平行2管 溶液D W 溶液C E0 25 溶液A S80 溶液B S80E0 25 各0 1mL 各0 1mL 各0 1mL 各0 1mL 2020 3 27 Http Page41 结果判断 当需要复检时 A溶液平行4管 若所有平行管均为阴性 则供试品合格 否则不合格 2020 3 27 Http Page42 2 凝胶法半定量试验 注 A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液 从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释成1倍 2倍 4倍 8倍 最后的稀释倍数不得超过MVD B为2 浓度标准内毒素的溶液A 供试品阳性对照 C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列D为阴性对照 反应项目设置 2020 3 27 Http Page43 凝胶半定量试验举例 试剂 凝胶半定量法一般选用灵敏度较高的鲎试剂 2020 3 27 Http Page44 各反应溶液的制备 溶液C的制备将CSE稀释成E0 125 E0 06 E0 03 E0 015浓度溶液溶液A的制备将供试品 S1 稀释至2倍 4倍 8倍 E1 25 0 4ml 3 6mlW 2020 3 27 Http Page45 加样及反应 溶液B的制备 近似稀释法 2020 3 27 Http Page46 结果判断 试验有效条件 溶液D 溶液B 溶液C E0 125 且E0 015 即0 5 c 2 2020 3 27 Http Page47 结果计算 所有平行管的反应终点浓度的几何平均值即为供试品的内毒素浓度 CE Lg 1 X 2 供试品内毒素浓度 CE 当溶液A所有平行管均为阴性时 供试品溶液的内毒素浓度小于 乘以初始稀释倍数 本试验初始稀释倍数为1 当溶液A所有平行管均为阳性时 供试品溶液内毒素浓度大于或等于 乘以最大稀释倍数 本试验最大稀释倍数为8 lg 1 2 lg0 125 lg0 06 0 08 EU ml 2020 3 27 Http Page48 7 实验相关知识及技巧 关于pH值的要求CP2005年版BET要求 一般要求供试品的pH值在6 0 8 0范围 USP的BET法要求是供试品与鲎试剂1 1的混合液的pH值在6 0 8 0 推荐的做法 在验证试验时 测定供试品溶