14 生物化学实验--酵母蔗糖酶米氏常数的测定

酵母蔗糖酶米氏常数的测定酵母蔗糖酶米氏常数的测定 目的目的 1 掌握蔗糖酶米氏常数测定的方法及原理 2 熟悉蔗糖酶米氏常数测定的及意义 3 验证底物浓度对酶促反应速度的影响 原理原理 当环境温度 pH 和酶浓度等条件一定时 酶促反应的初速度 V 随底物浓 度 S 增高而加快 直至达到一个极限 即最大反应速度 V max 依 据底物浓度与酶促反应初速度的这种关系 米 曼 Michaelis Menten 氏推倒出如下公式 称为米 曼氏方程式 式 3 1 方程式中 K m 称为 米氏常数 K m 是酶的特征性常数 等于反应速度达到最大反应速度一半时的 底物浓度 K m 可以近似地表示酶与底物亲合力的大小 K m 愈小 表明酶 与底物的亲合力愈大 测定 K m 是研究酶促反应动力学的一种主要方法 林 贝 Lineweaver Burk 氏将米 曼氏方程式等号两边取倒数得到的双 倒数方程为林 贝氏方程式 式 3 2 实验选择不同的 S 测定相对 应的 V 以 1 V 对 1 S 作图 得到一个斜率为 K m V max 的直线 将直 线外推与横轴相交 其横轴上截距即 1 K m 图 3 7 由此求出 K m V 式 3 1 式 3 2 斜率 K m V max Y 轴截距 1 V max X 轴截距 1 K m 图 3 7 双倒数作图法 本实验以酵母蔗糖酶为例 应用制备的酵母蔗糖酶 在 pH5 0 的醋酸缓冲液中 30 条件下测定其 K m 值 其过程是 当酵母蔗糖酶在有缓冲液存在时与 不同浓度的蔗糖混合 保持反应液的温度 30 反应 5min 后 测定还原糖 生成量 还原糖的定量测定 参见第 3 篇实验 18 以还原糖的生成量代表 反应开始阶段的初速度 V 按照 Lineweaver Burk 作图法求得 K m 值 器材器材 1 中号试管 2 刻度吸量管 3 微量移液器 4 恒温水浴箱 5 冷冻离心机 6 分光光度计 试剂试剂 1 0 2M pH5 0 醋酸缓冲液 0 2M 醋酸 30ml 与 0 2M 醋酸钠 70ml 混合 2 醋酸 钠 3 1 M 醋酸 4 0 03M 蔗糖溶液 1 蔗糖的纯化 在做实验前 用 Bendiet 氏试剂检验蔗糖中是否有还原糖 存在 如果有还原糖则需要将蔗糖纯化 纯化利用蔗糖和还原糖在乙醇中溶解 度的差异 表 3 7 蔗糖在绝对量上最多 将少量的还原糖从蔗糖中洗去 表 3 7 不同糖类在水和乙醇中的溶解度 糖 类 水中的溶解度 乙醇中的溶解度 蔗 糖 果 糖 葡萄糖 179 200 83 0 9 6 71 1 94 纯化操作 称取干燥的蔗糖 50g 置于 250ml 烧杯中 加入 95 乙醇 100ml 不时搅动 放置片刻后用布氏漏斗吸滤 沉淀用 50ml 95 乙醇淋洗 2 3 次 吸干沉淀 取少量用 Bendiet 氏试剂检验 应不具还原性 其余部分取出推置 玻璃板上 80 烘箱干燥后备用 2 精确称取纯化的蔗糖 10 26g 蒸馏水溶解 定容至 1 000ml 5 蔗糖酶溶液 1 自溶 称取 40g 的干酵母粉放在 250ml 三角瓶中 再分别放入 1 2g 醋酸钠细粉末 30ml 甲苯 充分搅拌使酵母液化 然后在 35 水浴中间隔片刻震荡 保温 30 分钟 此时会观察到菌体自溶现象 2 粗酶的制备 往上述自溶液中加入 100ml 水 充分搅拌 于 35 保温过夜 第二天 将 自溶液于 10 000r min 4 离心 10min 取出离心管后分三层 用吸 液管将最上层的甲苯吸去 然后可再用一药勺挡住中间块状粘稠物 倾斜离心 管倒出下层清夜 弃去粘稠物 此时会有一些悬浮物存在 再离心一次 10 000r min 4 离心 10min 滤清上清液 小心倒入 250ml 烧杯 中 得到的溶液为无细胞抽提液即粗酶液 用 1M 醋酸调节 pH5 0 左右 4 保存备用 3 蔗糖酶活性的预实验 在进行具体实验之前 通过预实验调节酶活性 即酶的浓度 使本实验中 最高底物浓度 在规定的实验条件下所测得的吸光度值控制在 0 8 左右 这样 能达到比较满意的效果 6 碱性铜试剂 标准葡萄糖溶液 0 025mg ml 磷钼酸试剂 参见第 3 篇实验 18 操作操作 1 制备酶反应液 取中号试管 5 支 编号 按照下表操作 试剂 ml 0 管 1 管 2 管 3 管 4 管 0 03M 蔗糖液 0 1 0 1 5 2 5 5 0 去离子水 5 0 4 0 3 5 2 5 0 pH5 0 醋酸缓 冲液 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 混匀 同时将蔗糖酶溶液一起置于 30 恒温水浴中 保温 5min 使温度达 到平衡 蔗糖酶 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 充分混匀 置于 30 恒温水浴中 准确保温 5min 碱性铜试剂 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 混匀 终止酶促反应 酶反应液留作还原糖的测定 2 还原糖的测定 取中号试管 6 支 编号 按照下表操作 试剂 ml 0 管 1 管 2 管 3 管 4 管 5 管 酶反应液 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 去离子水 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 0 碱性铜试剂 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 葡萄糖标准 液 0 0 0 0 0 2 0 混匀 沸水浴中加热 8min 取出后勿摇动 流水冷却 磷钼酸试剂 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 混匀 静置 3min 蒸馏水 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 混匀 用分光光度计于 650 nm 波长处比色测定 0 号管作空白调零 读取并 记录各管的吸光度值 3 计算还原糖的生成量 按下式计算各管酶反应液在 5min 反应时间内生成还原糖的毫摩尔数 还原糖的毫摩尔数 管 4 作图求 K m 值 按照 双倒数作图法 以各管的实际蔗糖浓度 即 1 S 作为横坐标 各管酶 反应液在 5min 反应时间内生成还原糖的毫摩尔数为反应速度 V 以 1 V 作 为纵坐标 作图 其横轴截距为 进一步求得 K m 值 注意事项注意事项 1 蔗糖酶的浓度与蔗糖的纯度直接影响实验结果 因此 必须纯化蔗糖和进 行蔗糖酶活性的预实验 2 本实验是一个定量测定方法 为获得准确的实验结果 应尽量减少实验操 作中带来的误差 因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释 保证底物 浓度的准确性 各种试剂的加量也应准确 并严格控制准确的酶促反应时间 3 当用 pH5 0 的醋酸缓冲液 在 30 测定时 酵母蔗糖酶的 K m 值约 为 28 mM 4 还原糖与碱性