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文档简介

碱性磷酸酶Km值的测定 实验目的 1 了解酶的Km值测定原理和方法2 掌握碱性磷酸酶 AKP 活性测定的原理和方法 实验原理 在温度 PH及酶浓度恒定的条件下 酶促反应的初速度随底物浓度 S 增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时 则反应速度趋于恒定 此最大反应速度Vmax 反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示 即 Vmax S V Km S 其中Km为米氏常数 Vmax为最大反应速度 当V Vmax 2时 则Km s Km是酶的特征常数 测定Km是研究酶的一种方法 将米氏方程变形为双倒数方程 以l v 1 s 作图 将各点连线 在横轴截距为 km 据此可算出Km值 1 V Km Vmax S 1 Vmax 本实验以碱性磷酸酶为例 用磷酸苯二钠为其底物 生成酚和磷酸 酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用 经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物 根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下 磷酸苯二钠 H2OAKPOH 苯酚苯酚 4 氨基安替比林K3Fe CN 6醌衍生物 红色 混匀后37 水浴 预温5分钟左右 实验操作 加入酶液后立即混匀 保持37 水浴 反应开始 从加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应 各管反应时间应准确一致 为15分钟 混匀 室温放置10分钟左右 以8号管为空白 于5l0nm比色 记录各管的光密度 实验结果 1 原始数据 2 作图 以 s 为横轴 OD510为纵横作图 观察曲线形状 查Km值以1 s 为横轴 1 OD510为纵轴作图 观察曲线形状 查Km值比较两个值的差异 S 底物浓度与反应速度关系曲线 双倒数曲线 比较两个值的大小 分析实验误差产生的原因比较两种Km测定方法各自的优缺点
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