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基因敲除 概念 基因敲除 geneknock out 又称基因打靶 该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组 进行精确的定点修饰和基因改造 具有专一性强 染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点 它是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的 目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活 点突变引入 缺失突变 外源基因定位引入 染色体组大片段删除等修饰和改造 并使修饰后的遗传信息通过生殖系遗传 使遗传修饰生物个体表达突变的性状 通过对遗传修饰生物体的表型分析和机理研究 帮助人类理解生命现象的本质 揭示疾病发生的机理 探寻疾病预防和诊疗的有效方法 基因打靶技术的发展简史 JoshuaLederberg由于在细菌中首先证实同源基因间重组的原理而获得了1958年的诺贝尔奖 Capecchi和Smithies都首先预见到新的遗传物质可以通过同源重组引入哺乳动物细胞的基因组 并对基因进行特异性修饰和改造 1980年 Capecchi报道用玻璃针将DNA直接注射入细胞核可以显著提高基因转移的效率 Capecchi随后证明同源重组可以发生在外源DNA和哺乳动物细胞染色体的同源序列间 证明这种有缺陷的抗性基因可以通过与外源DNA间的同源重组得到修复 1985 Smithies实现了人工打靶载体和细胞染色体上 球蛋白基因间的同源重组 Whitten于1956年成功地使单细胞的受精卵在体外发育到囊胚阶段 Brinster于1965年建立了微滴培养技术 用于着床前小鼠胚胎的培养 Mclaren等对输卵管移植和子宫移植条件进行了优化 并最终使得通过胚胎移植从体外培养的胚胎产生活的小鼠成为一种常规的技术 Gardner 嘉德纳 建立了将分离的细胞注射入宿主囊胚获得嵌合体小鼠的方法 1981年 Evans等和Marin分别报道从正常的小鼠囊胚中分离了ES细胞 Evans等研究小组在1984年证实通过显微注射引入囊胚的ES细胞可以分化为成体的各种组织并整合入生殖系 1987年 Evans等和Monk等的研究小组在小鼠胚胎干细胞中分别对次黄嘌呤磷酸转移酶基因 Hprt 的进行改造 并获得了经生殖系遗传的突变小鼠 1989年 真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠诞生 基因敲除技术与诺贝尔奖 在经历近20年的推广和应用后 基因打靶终于获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定 2007年10月8日美国科学家MarieCapecchi教授 和Oliversmithies教授以及英国MartinEvans教授分享了诺贝尔生理或医学奖 他们最大贡献在于 他们创造了一套完整的 基因敲除小鼠 的方式 把任意改变小鼠基因变为现实 不仅可以研究单个基因在动物体内的功能 而且为人类攻克某些遗传因素引发的疾病 提供了药物试验的动物模型 名词解释 同源染色体是指 一条来自父方 一条来自母方 形状 大小 结构基本相同 且在减数第一次分裂时能两两配对 联会 的染色体 联会后的两条同源染色体 是经过染色体复制后的 即每条染色体含有二条姐妹染色单体 二条染色体就含有四条染色单体 故叫四分体 在配对 联会 的一对同源染色体中 由一个着丝点相连的二条染色单体叫姐妹染色体单体 由不同着丝点相连的染色单体 就叫非姐妹染色单体 因此应该说在减数第一次分裂时 联会 配对 的同源染色体中 既有姐妹染色单体 也有非姐妹染色单体 同源染色体交叉互换 同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似DNA序列间的重组 它通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段 同源重组在进化过程中高度保守 胚胎干细胞 embryonicstemcell ES 胚胎干细胞是早期胚胎 原肠胚期之前 或原始性腺种分离出来的一类细胞 具有体外培养无限增殖 自我更新和多向分化的特性 嵌合体 遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体 免疫学上则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在 彼此能够耐受 不产生排斥反应 相互间处在嵌合状态 同一器官出现不同性状的生物体 纯合体又称同型合子或同质合子 由两个基因型相同的配子所结合而成的合子 亦指由此种合子发育而成的生物个体 纯合体的同源染色体 在其对应的一对或几对基因座位上 存在着完全相同的等位基因 如AA aa AABB AAbb aaBB AABBcc aaBBcc等等 具有这些基因型的生物 就这些成对的基因来说 都是纯合体 在它们的自交后代中 这几对基因所控制的性状 不会发生分离 G418是一种氨基糖苷类抗生素 在分子遗传试验中 是最常用的抗性筛选试剂 当neo基因被整合进真核细胞DNA后 能启动neo基因编码的序列转录为 从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 使细胞获得抗性而能在含有 418的选择性培养基中生长 neo基因 是对新霉素 neomycin 的抗药基因 细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素 破坏卡那霉素和新霉素 原核生物 以及G418 TK 胸苷激酶蛋白基因 可使无毒性的丙氧鸟苷 GANC 转变为毒性核苷酸而杀死细胞 因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株 HSV tk 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 编码的酶蛋白 可以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质 杀死肿瘤细胞 这些基因也被称为自杀基因 同源重组基因敲除 原理 利用DNA转化技术 将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞 通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组 将外源基因整合入内源基因组内 使外源基因得以表达 通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变 达到研究基因功能的目的 分类 完全性基因敲除条件性基因敲除诱导性基因敲除 完全基因敲除 完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除 技术路线基因载体的构建ES细胞的获得同源重组选择筛选已击中的细胞表型研究得到纯合体 打靶载体 基因载体包括载体骨架 靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列 其中同源序列是影响同源重组效率的关键因素 通常都包含有两段与打靶目标位点两端同源的区域 中间一段不同源且为目的序列 并带有某种药物筛选标记 新霉素抗性基因Neo具有双重作用 一方面导致靶基因的插入突变 同时作为重组细胞的正向筛选标志 该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长 ES细胞的获得 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞 最常用的是鼠 而兔 猪 鸡等的胚胎干细胞也有使用 常用的鼠的种系是 及其杂合体 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向 是基因敲除的理想实验动物 同源重组 将重组载体通过一定的方式 电穿孔法或显微注射 导入同源的胚胎干细胞 EScell 中 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中 从而得以表达 一般地 显微注射优点是外源基因转移率高 可直接用外源基因进行转移 缺点是转移基因表达不稳定 技术难度较大 效率低 电穿孔命中率比显微注射低 但便于使用 选择筛选已击中的细胞 由于基因转移的同源重组自然发生率极低 动物的重组概率为10 2 10 5 植物的概率为10 4 10 5 因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要 表型研究 通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变 达到研究目的基因的目的 得到纯合体 由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中 所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型 需要进行至少两代遗传 载体构建 获得目的基因 待敲除基因 的同源片段 将此 片段克隆到一般的质粒载体中 从重组质粒中切除目的基因的大部分同源 序列 只留部分序列在线性质粒载体的两端 将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中 使之位于残留目的基因同源顺序的中间 在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体 将 tk基因克隆到此线性载体中 根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的不同 基因载体通常分为两种 1 插入性载体 gene insertionvector 断裂位点位于同源序列区域内 选择基因紧邻同源目的序列 基因重组时整个载体整合到染色体靶位点上 载体DNA同源序列与染色体靶位点进行一次同源重组 2 置换型载体 gene replacementvector 断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧 选择基因位于同源目的序列内部或外侧 基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列 载体DNA同源目的序列与染色体靶位点进行两次同源重组 目前 大多数基因敲除实验都采用置换型载体进行 基因打靶的主要筛选策略 正负筛选策略 positiveandnegativeselection PNS 正相选择法 positiveselectionmethod PCR法 正负筛选法 PNS法 所设计的载体包含10 15kb与靶基因同源的片断 一个neor基因插入到载体同源序列内的一个外显子中部 作为正选择标记 在同源区外插入一个tk基因作为负选择标记 正相选择法 在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选择基因neor 目的基因片段也不包含该基因的启动序列 再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内 将打靶载体转染进靶细胞 可能出现下面几种情况 打靶载体不整合入靶细胞基因组 将随传代而丢失 随机整合 由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码 整合位点周围亦无启动子 使neor基因的表达受阻 虽是随机整合 但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组 则neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性 用G418筛选 则抗性细胞中将只包含 根据基因组DNA酶切图谱的不一致 用Southern印迹杂交可检测出同源重组的克隆 PCR法 PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆 选择性地扩增发生同源重组的DNA片段 先在靶载体中插入neor基因使其突变 然后合成两个引物 它们分别位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上 将G 418抗性细胞克隆分别进行PCR 发生同源重组时 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增 结果是DNA片段的拷贝数以指数式增加 得到已知长度DNA双链片段 与之相反 在随机整合中 由于只有一个引物且为单方向 所以扩增的片段拷贝数呈线性比例 片段为单链 长度不定 筛选方法的特点 PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两种重要的方法 但它们都有不足之处 PCR法缺乏直接的选择标记 运用PCR法进行筛选时 必须对每个细胞克隆分别进行扩增 因此较为费时费力 工作量非常大 PNS法可能是目前应用最广泛的方法 但PNS法要经过2种药物筛选 有可能对ES细胞产生潜在的影响 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因 基因敲除的影响因素 基因打靶的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的细胞数与转染的细胞总数之比 又称同源重组效率 基因打靶效率在不同的研究报道中变动范围较大 其波动性来自较多的影响因素 1 打靶载体的影响同源片段的来源影响 尽量选择与靶细胞相同品系的基因片段作为同源片段 可减少碱基错配 当载体同源序列长度从4kb增加至9kb时 基因打靶效率增加10倍 研究发现 同源序列达一定长度后 继续的增加对同源重组效率不产生显著影响 2 外源DNA导入方式的影响目前 外源DNA导入的方式主要有显微注射法 电穿孔法 精子载体法和逆转录病毒感染法 不同的导入方法对同源重组效率有明显影响 目前应用最广的是显微注射法 用显微注射法导入可得到很高的转染率 占接受外源DNA细胞的10 20 但显微注射每次只能注射一个细胞 而用电穿孔法可同时使许多细胞得到转染 可使1 的ES细胞稳定转染 精子载体法 对精子细胞灭能 破坏细胞膜 后与转基因载体DNA混合共浴 使其具有携带外源基因的能力 然后 将精子头部直接注射入卵细胞 经过人工受精的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育 获得转基因动物个体 该方法的优点是简便 经济 易行 同时不涉及对动物进行手术处理 反转录病毒载体 将外源基因附着在经过修饰已经除去有害部分的病毒体上 导入细胞 实现基因的传递 病毒载体的主要优点有 能在转化的细胞中稳定表达并遗传外源基因DNA分子 转移效率较高 其主要缺点表现在对外源基因的容纳量较小 3 靶基因的影响研究证明 生物基因组中的不同区域由于其结构组成和功能状态的不同 会导致在这些位点进行基因打靶时的打靶效率出现很大的差异 此外 目的基因插入片段大小 载体DNA是否线形化等也影响基因打靶的效率 琼脂糖凝胶电泳DNA变性并转膜Southern印迹 看不到DNA条带转到膜上用非特异性DNA或蛋白质封闭 然后与标记的探针温育 照相检测阳性条带 显亮 基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡 使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能 某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能 完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型 使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的 还是由几种细胞共同引起的 近年来 条件性基因打靶 conditionalgenetargeting 系统的建立 使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确 效果更加精确可靠 已达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官 组织的选择性敲除 条件基因敲除 条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法 它实际上是在常规的基因敲除的基础上 利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术 在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的 按钮 从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态 原理 利用Cre LoxP和来自酵母的FLP frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型 通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP 并以此两侧装接上loxP的 loxPfloxed ES细胞产生 loxPfloxed 小鼠 然后 通过将 loxPfloxed 小鼠与Cre转基因鼠杂交 也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶 产生靶基因发生特定方式 如特定的组织特异性 修饰的条件性突变小鼠 在 loxPfloxed 小鼠 虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP 但靶基因并没有发生其他的变化 故 loxPfloxed 小鼠表型仍同野生型的一样 但当它与Cre转基因小鼠杂交时 产生的子代中将同时带有 loxPfloxed 靶基因和Cre基因 Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应 结果将一个loxP和靶基因切除 这样 靶基因的修饰 切除 是以Cre的表达为前提的 Cre的表达特性决定了靶基因的修饰 切除 特性 即Cre在哪一种组织细胞中表达 靶基因的修饰 切除 就发生在哪种组织细胞 而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率 所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度 Cre loxp系统 Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现 属于 Int酶超基因家族 Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp EMBL数据库登录号X03453 编码38kDa蛋白质 Cre重组酶是一种位点特异性重组酶 能介导两个34bp的LoxP位点之间的特异性重组 使LoxP位点间的序列或基因被删除 loxP位点 一段长34bp的DNA序列 含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列 这段34bp序列是重组酶识别的位点 5 ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT 3 3 TATTGAAGCATAT TACATACG ATATGCTTCAATA 5 Cre重组酶介导两个LoxP可以分成三种情况 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上 且方向相同 Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上 但方向相反 Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位 如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上 Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位 Cre loxP系统的工作流程制备基因打靶小鼠 在目的基因必需外显子两侧的内含子中各插入一个loxP位点 通过胚胎干细胞的同源重组制备基因打靶小鼠 制备Cre转基因小鼠 这一鼠系中Cre重组酶的表达受控于一个特异性启动子 该启动子决定了Cre表达的组织或细胞类型 制备目的基因敲除的小鼠 基因打靶小鼠和Cre转基因小鼠杂交 产生的双重转基因小鼠因Cre的组织特异性表达 而使两侧具有同向loxP位点的基因片段被敲除 导致基因功能的丧失 很明显 在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子 只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达 使其在生物体特定的部位 特定的条件下产生 就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除 迄今为止 研究者们已经成功地利用多个不同的启动子实现了在不同条件下的基因敲除 这些启动子可以是细胞类型特异的 如lck启动子 胸腺细胞 乳清酸性蛋白启动子 乳腺 aP2启动子 脂肪组织 AQP2启动子 肾脏集合管 和肌浆蛋白启动子 骨骼肌 等 启动子也可以受某些外源性化学物质的调控 外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用 如干扰素反应Mxl启动子 他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等 Cre loxP系统作用原理示意图 Cre loxP系统优点 Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后 可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程 因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子 loxP位点是一段较短的DNA序列 因此非常容易合成 Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质 可以在生物体不同的组织 不同的生理条件下发挥作用 Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下 从而使这种重组酶在生物体不同的细胞 组织 器官 以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生 进而发挥作用 这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点 这一技术亦存在一些缺点 费用太高周期较长许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变 可能是这些基因的功能为其他基因代偿所致 条件性基因打靶的优势 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死并能客观 系统地研究基因在组织器官发生 发育以及疾病发生 治疗过程中的作用和机制 诱导基因敲除 诱导性基因敲除也是以Cre loxp系统为基础 但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点 通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性 从而在loxp动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制 以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象 常见的几种诱导性类型如下 四环素诱导型 干扰素诱导型 激素诱导型 腺病毒介导型 诱导性条件性基因打靶策略 制备基因打靶小鼠 在目的基因必需外显子两侧的内含子中各插入一个loxp位点 通过胚胎干细胞的同源重组制备基因打靶小鼠 制备可诱导性表达Cre的转基因小鼠 这一鼠系中Cre的表达受控于rtTA调控系统 该系统决定了Cre表达的时间 制备目的基因敲除的小鼠 基因打靶小鼠和可诱导性表达Cre的转基因小鼠杂交 产生的双重转基因小鼠因Cre的诱导性表达 而使两侧具有loxP的基因片段被敲除 导致基因功能的丧失 诱导性基因敲除优点 诱导基因突变的时间可人为控制 可避免因基因突变而致死胎的问题 在2个loxP位点之间的重组率较高 如用病毒或配体 DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达 则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程 利用随机插入突变进行基因敲除 原理 利用某些能随机插入基因序列的病毒 细菌或其他基因载体 在目标细胞基因组中进行随机插入突变 建立一个携带随机插入突变的细胞库 然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 根据细胞的不同 插入载体的选择也有所不同 逆转率病毒可用于动植物细胞的插入 对于植物细胞而言农杆菌介导的T DNA转化和转座子比较常用 噬菌体可用于细菌基因敲除 基因捕获 genetrapping 技术也是一种产生大规模随机插入突变的便利手段 对于揭示基因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值 基因捕获技术的基本过程是 将一含报告基因 通常是neo基因 的DNA载体随机插入基因组 产生内源基因失活突变 通过报告基因的表达 提示插入突变的存在 以及内源基因的表达特点 利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库 每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因 ES细胞克隆经囊胚注射发育为基因突变动物模型 通过对动物模型的表型分析鉴定突变基因的功能 每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因 在短期内可建立大量含不同基因突变的ES细胞克隆库 突变基因的序列可通过基于PCR的一些方法鉴定 同时还可能发现一些在体内表达或不表达的新基因 基因捕获载体 根据报告基因在载体中的位置及报告基因激活表达的方式 基因捕获分为3种类型 增强子捕获载体 enhancer trapping 启动子捕获载体 promoter trapping 基因捕获载体 增强子捕获载体 含有一个最小的启动子和翻译起始位点 当载体整合到顺式增强子元件附近时 此增强子将调控报告基因的表达 增强子捕获载体在lacZ报告基因上游含有一个最小的截短型热休克诱导启动子 载体插入到X基因的增强子附近时 报告基因lacZ转录并翻译 启动子捕获载体 由不含启动子成分的报告基因和一筛选标记基因组成 只有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本时报告基因才可能表达 因而启动子捕获的致突变比率很高 然而载体插入到外显子的频率非常低 捕获效率较增强子捕获至少低200倍 启动子捕获载体 启动子捕获载体需插入到X基因的编码区产生X基因与lacZ的融合转录本及蛋白 基因捕获载体 基因捕获载体中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别含有剪接受体 spliceacceptor SA 和多聚腺苷酸加尾序列 polyA 当含有顺式作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活时 载体中SA与内源基因剪接供体 splicedonor SD 作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融合转录本 使内源基因发生突变 同时报告基因的表达提示内源基因的表达特点 基因捕获 基因捕获载体插入到内含子中 X基因转录激活时 产生X基因外显子与lacZ报告基因的融合转录本 基因捕获的表达筛选 对基因捕获小鼠系的表型筛选通常效率较低 因此 许多研究通过报告基因的表达来评定基因捕获插入是否破坏特异发育途径 由于ES细胞具有在体外分化为多种细胞类型并且能对多种生理及分子信号作出反应的特性 体外分化ES细胞成为基因捕获表型筛选的重要手段 基因捕获技术中存在的问题 载体的导入方法 基因捕获载体可通过逆转录病毒感染法或电转化法引入基因组 前者可能产生更高比例的功能失活 无义 突变 而后者通常显示为基因组内随机插入 更适用于产生等位基因系列 重复捕获 有些基因比其他基因更容易被捕获 有报道显示 用不同的捕获策略可捕获同一个基因两次 基因捕获表达分析 利用报告基因的表达模式揭示内源基因的表达是基因捕获克隆主要的预筛选手段 然而一些证据表明 galactosidase的表达有时比内源基因的表达更局限 表型缺失 即使经过预筛选 有些突变克隆产生的小鼠系也没有明显表型 突变基因的克隆和序列测定 基因捕获内源基因的鉴定是整个研究过程中的主要瓶颈 到目前为止 只有少数突变克隆基因被鉴定 基因捕获技术可节省大量构建特异打靶载体 以及筛选染色体组文库的工作及费用 成为可同时对基因的序列 基因的表达以及基因的功能进行研究的高效技术 随机突变筛选策略能够获得功能基因研究的新材料及人类遗传性疾病的新模型 这种 表型驱动 的研究方式有可能成为功能基因组研究最有前景的手段和捷径 此方法的缺点是只能剔除在Es细胞中表达的基因 另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰 RNA干扰 RNAinterference RNAi 是指在进化过程中高度保守的 由双链RNA double strandedRNA dsRNA 诱发的 同源mRNA高效特异性降解的现象 简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象 所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除 RNAi是机体的一种天然防御机制 具有防御病毒感染 入侵等功能 目前利用RNAi能够在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点研究基因的功能已成为功能基因组学的热点之一 RNAi引起的基因敲除 作用机制 向细胞导入人工合成的双链RNA dsRNA dsRNA进入细胞后被Dicer酶切割成21 23核苷酸的小分子干扰RNA siRNA 此siRNA与Dicer酶及相关蛋白形成RNA诱导沉默复合物 RISC 继而siRNA解双链 复合物被激活 siRNA反义链与mRNA互补区域结合 从而引导Dicer酶切割该mRNA使之失活 导致特定基因功能丧失 同时 在RNAi过程中 反义siRNA杂交到目标mRNA上 在RdRP 以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶 的作用下 扩增到反义RNA全长 这些dsRNA被Dicer酶消化剪切成新的siRNA 进而实现siRNA的扩增 RNAi的作用机制示意图 目前有5种方法可用于制备siRNA 化学合成法体外转录法长链dsRNA的RNase 体外消化法siRNA表达载体法siRNA表达框架法 前3种方法是在体外制备然后导入到细胞中 后两种则是基于具有合适启动子的载体或转录元件 在哺乳动物或细胞中转录生成 目前多采用RNA聚合酶 启动子构建siRNA的表达载体或表达框架 常用的RNA聚合酶 的启动子有人 鼠U6启动子 人H1启动子 研究者既可以将siRNA导入特定细胞 在细胞水平上研究基因的功能 也可以通过转基因的方法 在动物体内实现特异 稳定 长期地抑制靶基因的表达 从而在整体水平上研究基因的功能 若将RNAi技术与Cre loxP重组系统以及基因表达调控系统相结合 建立转基因动物模型 则不仅具有稳定 可遗传 可诱导等特点 而且无需使用胚胎干细胞技术和基因打靶技术 与基因敲除相比具有简单 易操作 周期短等优势 已被作为一种简便和有效的工具广泛用于基因功能的研究 优点 简单省时 比用同源重组法更加简洁 周期大大缩短 对于一些敲除后小鼠在胚胎时死亡的基因 可在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究功能 高效性和特异性 少量dsRNA就能导致内源基因几乎100 的沉默 多效性 通过仔细地选择靶基因序列片段 可选择性沉默某一基因家族中的单个基因 部分甚至全部家族基因的表达 可选择性 通过采用不同的启动子 如诱导型 组织特异型 来抑制某一发育阶段 某一器官的基因表达 缺点 该技术可能对靶基因的相似序列发生作用 导致脱靶 off targeting 效应 还可能诱导干扰素和其他细胞因子的表达 应用 基因功能的研究 后基因组时代主要任务就是研究大量新基因的功能 用体细胞基因打靶技术通过定点改造基因组中的特定基因 有可能在细胞水平上研究某一基因的功能及调控机制 从定点突变的干细胞获得基因突变型个体 可在生物体整体水平上了解某些基因在体内的具体作用 另外 胚胎发育是非常复杂的生命现象 在这一过程中包含着许多生理 生化的复杂变化 尤其是要考察某一基因对某一组织器官发育的影响 用传统的研究方法很难进行观察研究 基因打靶为这一领域的研究提供了理想的方法 建立人类疾病的动物模型 人类疾病动物模型对病理研究及临床治疗非常重要 自发或诱变病理模型需漫长的时间 应用转基因技术 外源基因在基因组中的随机整合可能带来不确定的表型 基因打靶技术在很大程度上克服了上述不足 通过对ES细胞打靶可获得含特定突变基因的小鼠模型 老鼠和人类在外观和行为上的巨大不同掩盖了二者的相似之处 它们有95 的基因是相同的 二者有相似的肝脏 大脑 免疫系统 会患癌症 心脏病 神经系统疾病等同样的疾病 从这个角度看 老鼠可以被看作 袖珍人类 用于疾病的基因治疗 通过基因敲入技术将正常基因