基因治疗肿瘤的策略及进展生物探索ppt课件.ppt

基因治疗肿瘤的策略 陈莉 肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗最引人瞩目的研究领域 是继手术 放疗 化疗 免疫治疗之后的第五种模式 是肿瘤治疗的有益补充 基因治疗就是用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法 基因治疗的基本程序 1 目的基因准备 2 受体细胞 靶细胞 培养 3 载体的选择与克隆 4 将目的基因导入靶细胞 5 转导细胞的选择和鉴定 6 基因治疗的安全性鉴别及疗效评价 基因治疗的主要措施有 1 基因置换 genereplacement 将致病基因整个的换以正常基因 使致病基因永久的得到更正 2 基因修正 genecorrection 将基因的突变碱基序列纠正 而正常部分给予保留 3 基因修饰 geneaugmentation 将目的基因导入病变细胞或其它细胞 目的基因的表达产物修饰改变缺陷细胞的功能 或使原有的功能得到增强 4 基因失活 geneinactivation 应用反义核苷酸或核酶特异的封闭某些致病基因的表达 区别几个概念 将目的基因导入细胞或细菌 针对目的基因叫做转移 transfer 针对宿主细胞叫做转导 transduction 而这一过程叫做转染 transfection 目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫做转化 transformation 第一节增强宿主抗肿瘤免疫 肿瘤疫苗的作用抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方案 为增强机体免疫系统对肿瘤的识别 免疫基因治疗主要包括一 通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递 二 增加肿瘤细胞表达细胞因子 三 增强肿瘤细胞表达的共刺激分子 一 以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫通过APC AntigenPresentingCells 增强对肿瘤抗原的识别与呈递 将编码目的抗原的基因 以重组表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞 借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子 如通过主要组织相容性复合体 MajorHistocompatibilityComplex MHC 和 或MHC 类分子抗原处理和输送途径将抗原信息呈递给T淋巴细胞 从而激发体液免疫和细胞免疫 二 细胞因子的免疫基因治疗将IL 1 IL 4 TNF IFN等细胞因子基因导入肿瘤细胞 使瘤细胞表达出相应的抗原 随后激发CD4 毒性T淋巴细胞 CytotoxicTLymphocyte CTL 反应 而导致分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解 以达到治疗肿瘤的目的 如Shiau等在体内给予表达干扰素 的逆转录病毒进行鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗 其目的是增加肿瘤细胞在局部产生干扰素 以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的 这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用 这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性 细胞 HelperTLymphocyte TH 的作用 并对机体内远处的肿瘤具有抑制作用 将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞 TumorInfiltratingLymphocyte TIL 和淋巴因子激活的杀伤性细胞 LymphokineActivatedKillercell LAK细胞 使之活化 活化的TIL具有显著抗自身肿瘤作用 回输体内后趋向于肿瘤局部聚集 并大量表达其携带能增强抗肿瘤免疫的细胞因子基因产物 Hull等比较了伴有IL 12和共刺激分子B7 1 AdmIL12 B7 两个载体表达的腺病毒和单纯伴有IL 12 B7 AdmIL 12 表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的RM 9鼠前列腺癌模型 研究发现在感染的RM 9鼠肿瘤细胞中AdmIL 12 B7能介导IL 12分泌和增加B7 1在细胞表面的表达 通过在比较体内注射AdmIL 12 B7 AdmIL 12和对照组的疗效比较显示前者能明显的减少肿瘤体积和增加鼠的存活率 使用两个载体的肿瘤治疗将滤过更多CD4 CD8 的免疫反应细胞 三 共刺激分子的作用将MHC 类抗原基因导入肿瘤细胞 使宿主免疫系统识别肿瘤细胞为 异己 以诱发抗肿瘤免疫反应 可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精髓 既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白 又可以方便地精选所需基因片段 以激发理想的免疫反应 Matubonis等研究的结果表明 某些肿瘤细胞APC表面存在有共刺激分子B7 16 CD80 表达时 更难有效地激活CTL 基因疫苗激活的CTL具有高度的特异性和MHC I类分子限制性 其目的在于排除细胞外蛋白与核酸的侵袭 这对防止杀伤作用的扩散及维持机体核酸物质的稳定具有重要意义 应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在 特别是肿瘤特异性抗原 只有这样才可使诱导的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织 以往寻求肿瘤特异性抗原 先从寻找癌基因开始 然后再从基因推导肽片断 近年来发展了一个原来方法相反的研究路线 即先分离可识别肿瘤特异性肽的CTL 再通过CTL寻找其编码肽的基因 通过这种方法 发现了黑色素瘤基因MAGE 1 其编码的抗原可为人类黑色素瘤的特异性T细胞所识别 HuXueyou等合成了MAGE AL九肽 负载自体APC后给病人免疫 发现可引起原位和远距离部位的自体黑色素瘤反应和特异性CTL数量增加 说明此法可诱导肽特异性CTL应答并进行循环 这一研究结果为特异性抗黑色素瘤的免疫治疗显示了良好的应用前景 免疫基因治疗有助于克服抗癌治疗中碰到的肿瘤异质性 化疗耐受性 肿瘤细胞低免疫原性等困难 第二节恢复和增强抑癌基因的功能 引入抑癌基因抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因 将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞 其表达产物通过复杂的基因调节或活化代谢机制 能抑制肿瘤的恶性生长 甚至可导致癌细胞逆转 虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与 多步骤形成的过程 但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性的作用 用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺失 将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动物体内 以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性 从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的 基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研究阶段 如通过载有野生型P53的腺病毒载体进行瘤体内注射 这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗方法代表了癌症治疗的策略之一 用肿瘤抑制基因如P53 Rb治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的 体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有 转导WT p53能使结肠癌 骨肉瘤 神经胶质瘤 腺癌增殖降低 转导Rb基因能使视网膜母细胞瘤 骨肉瘤 前列腺癌增殖降低 转导wT 1能使裸鼠体内wilms 瘤形成下降 转导NF1能使神经纤维瘤病病灶减少 增加p16基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少 在实体肿瘤中抑癌基因P53分子对由化疗引起的DNA损伤有重要的作用 可引起细胞周期停滞与促使细胞凋亡 在食道癌研究中已获疗效 自从1994年Okamato等构建含有p16INK4cDNA的表达载体pCMV p16 成功地转染p16INK4基因缺失的肺癌细胞系Calu 6和卵巢癌细胞系SKOV 3 抑制了瘤细胞株的集落形成率 并使瘤细胞的继续生长得到控制 此后 在头颈部癌 卵巢癌中用腺病毒介导野生型P53去消除P53的突变 取得一定的疗效 Nakamura等用野生型P53肿瘤抑制基因替代疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成功 还有待于临床阶段的进一步工作证明 Schrump等对食管鳞状细胞癌系 Fueyo Higashi等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行p16INK4基因替代治疗研究 证明p16INK4基因的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长 进一步的研究发现 这种抑制作用是有选择的 对Rb基因缺失以及p16INK4基因正常的肿瘤细胞无明显抑制作用 在研究中人们还发现p16INK4基因正常的癌细胞株往往都有p53基因异常 p53基因正常的癌细胞株常有p16INK4基因变异 同时伴随cyclinD1的过度表达 因此 p16INK4基因与其它基因联合治疗将能更好地抑制肿瘤 Sandig等用p53 p16重组病毒注射到患肝癌的小鼠中 肿瘤生长出现逆转 提示了引入抑癌基因在肿瘤治疗中的前景 第三节阻断癌基因功能 反义核酸RNA干扰技术细胞中原癌基因的表达受到严格控制 ras myc src这一类癌基因由于突变而使其功能处于异常活跃状态 不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传递通路 促使细胞异常生长 因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入癌细胞来拮抗癌基因 或引入非等位rev等方法 阻止癌基因功能 反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的DNA或RNA 以影响其靶基因的表达 抑制其功能 RNA干扰 RNAinterference RNAi 是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程 为双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程 是一项新兴的基因阻断技术 RNAi是一种转录后基因沉默 posttranscriptionalgenesilencing PTGS 现象 有关基因沉默现象最早的报道见于植物中 1995年Gou等在对线虫的实验中发现 正义RNA与反义RNA一样可以阻断par 1基因的表达 但作者对这一现象没有进行更深入的研究 1998年 Fire等首次将正义链和反义链的RNA结合物 双链RNA doublestrandedRNA dsRNA 注入线虫 结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默 每个细胞只要很少几个分子的双链RNA就足以完全阻断同源基因的表达 后续的实验还证实 在线虫体内注入双链RNA 不但可以阻断整个线虫的所有同源基因的表达 还会导致其第1代子代的同源基因沉默 他们将这种现象命名为RNAi 此后 在多种生物体内陆续发现了RNAi现象 许多学者认为 在生物中广泛存在的PTGS现象可视作不同物种所共有的适应保护机制 通过阻抑大量的异常mRNA表达 抵抗转座子和病毒的侵袭 以保护机体免于受损 相当于基因组的免疫系统 通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用 RNAi在哺乳动物中的研究主要集中在干扰病毒在体内的复制 抑制癌基因表达及基因敲除后基因功能的研究等方面 与传统的基因研究方法 基因敲除 定点突变 反义核酸及核酶技术等相比 RNAi具有以下五大特点 基因序列特异性 dsRNA的稳定性 沉默信号传递性 Knock down高效性 RNAi效用浓度依赖性 一 RNAi的分子机制外源性 如病毒 或内源性的dsRNA在细胞内与一种RNA酶 RNAase 核酸内切酶 Dicer结合 随即被切割成21 23nt的带有3 端单链尾巴及磷酸化5 端的短链dsRNA 即小干扰RNA smallinterfereingRNA siRNA siRNA与Dicer形成RNA引导沉默的复合体 RNAinducessilencingcomple RISC siRNA作为引导序列 按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA 并引导RICS结合mRNA 随后siRNA与mRNA在复合体中换位 核酸酶Dicer将mRNA切割成21 23nt的片段 特异性地抑制靶基因的表达 而新产生的dsRNA片段可再次形成RISC 继续降解mRNA 从而产生级联放大效应 因此 每个细胞只需要几个siRNA分子就能够引起强烈的RNAi效应 此外 siRNA还可以在RNA依赖性RNA聚合酶 RNAdependentRNApolymerase RdRp 的作用下进行大量扩增 并转运出细胞 使RNAi扩散到整个机体并可以传代 阐明siRNA在双链RNA诱发的基因沉默中的作用是RNA干扰研究中最重要的发现之一 达到这一目的有几种途径 利用质粒载体或病毒载体转化或转染瘤细胞 在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA 从而阻断目的基因蛋白质的表达 体外人工合成反义寡聚核苷酸 由于脱氧核苷酸的合成较容易 在体液中也比较稳定 而脱氧核苷酸也同样可以与RNA相互配对结合 所以在实践中多用反义核苷酸 antisenseoligodeoxyribonucleotide AS ODN 与蛋白质水平相比 从遗传水平抑制基因表达能更有效地阻断疾病的发生发展 二 RNAi在肿瘤治疗中的意义ras基因包括K ras H ras N ras 是鸟苷酸结合蛋白 对细胞的繁殖 分化和细胞生存起调控作用 ras基因突变可使之处于长期激活GTP结合状态 易导致肿瘤的发生 K ras基因在人类肿瘤中最普遍活化状态的致癌基因 在肿瘤组织中的突变率30 50 在胰腺癌中高达85 突变的Ras基因与正常细胞中的野生型ras基因通常只有一个碱基的不同 但由于RNAi的高度特异性 可以针对肿瘤细胞中突变的ras基因产生抑制作用 而对正常细胞的野生型ras不产生抑制作用 最近Li MoChen等报道建立K rasV12突变基因的siRNA腺病毒表达载体 转染Panc 1胰腺癌细胞诱导凋亡 逆转肿瘤恶性表型 WeiWang等通过构建K ras基因的siRNA表达框架 siRNAexpressioncassette SEC 成功抑制胰腺癌细胞株MiaPaCa 2的K ras表达 Fleming等报道 利用化学合成anti K ras siRNA抑制了PANC 1和MaiPaca 2胰腺癌细胞K ras的表达 并观测到集落形成能力 细胞增殖能力和侵袭能力降低 凋亡增加 与VEGF 和血小板反应素 thrombspondin 1 TSP 1 基因和c myc的下游调控元件 与肿瘤转移相关的葡萄糖转运蛋白1 glucosuetransporter GLUT 1 基因表达变化 癌胚抗原相关细胞黏附分子6 CEARAM6 是免疫球蛋白超家族的成员 在许多肿瘤中都有表达 对肿瘤的形成 抵抗 失巢凋亡 anoikis 正常内皮细胞或表皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象 和形成转移起到重要作用 DuxburyMS等通过化学合成anti CEARAM6 siRNA抑制失巢凋亡高抵抗性MiaPaCa 2胰腺癌细胞株的CEARAM6的表达 观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及肿瘤细胞在体内 外模型中转移能力的降低 他们还分别利用逆转录病毒siRNA表达载体和化学合成的方法介导了对CEARAM6基因高表达BXPC3胰腺癌细胞株CEARAM6基因的敲减 观测到肿瘤细胞侵袭能力降低 转移瘤生成能力下降 进一步证明了CEARAM6基因在肿瘤形成 转移过程中起重要作用 为肿瘤的RNAi治疗提供了作用靶点 BCR ABL融合基因是定位于人9q34上的C ABL基因和22q11上的BCR基因发生t 9 22 易位 使相应无关的基因发生融合而形成 它是PH染色体的分子基础 在CML发病中起到重要作用 Borkhardt等采用RNAi技术成功地抑制了K562白血病细胞中的BCR ABL融合基因mRNA的表达 增加对K562白血病细胞凋亡的诱导作用 但在联合ABL酪氨酸抑制剂 Imatinib治疗时 对细胞凋亡没有相加作用 RNAi技术的快速发展必将推动生物学和医学的大步前进 RNAi在医学领域的应用也必将为各种疾病尤其是肿瘤等疾病的根治带来希望 但是 从目前RNAi的研究现状来看 在哺乳动物中 RNAi并不能完全阻断基因的表达 尤其是异常高表达的基因 这将促使人们去探索研究新的更高效siRNA表达载体体系 为了促进基于RNAi的基因药物进入临床研究和应用 大量的研究已集中到提高siRNA分子的工业化生产能力 增加siRNA分子稳定性 开发siRNA药物的靶向传递系统等方面 尽管如此 RNAi在癌症治疗中的应用已经取得非常大的成就 因此我们有理由相信RNAi必将对癌症的最终根治起到重要的作用 第四节核酶用于基因治疗1983年美国Cech和Altmann发现并鉴定了一类具有酶催化作用的核苷酸片断 称为核酶 Ribozyme 这一发现使酶的概念从蛋白领域扩展到核酸领域 核酶具有核苷酸内切酶的活性 它能在无蛋白质的条件下切割靶RNA分子 核酶用于基因治疗的条件是 找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质 这种蛋白的氨基酸序列 和编码基因序列 必须是已知的 以便设计核酶的切割位点 所设计的核酶必须能够切割靶RNA 肿瘤细胞必须能摄取这种核酶 并能在细胞内切割靶RNA 反义治疗并不像刚开始人们所想像的那么简单 目前还有许多关键性问题有待去解决 如生物学稳定性 药物的释放系统 以及由序列特异性和非特异性所引起的作用包括毒副作用等 应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有Ha ras c myc c fos c jum c erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因 或端粒酶的RNA部分 第五节抗肿瘤血管生成的基因治疗肿瘤的生长 转移与新生血管的形成密切相关 由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子 血管生长抑制因子以及其它的因子的共同调控 因此通过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的 一 阻断血管生长因子的作用主要是采用反义DNA 中和性抗体 受体酪氨酸激酶的抑制剂以及核酶等 用腺病毒载体介导的VEGF的拮抗物输入鼠卵巢癌抑制VEGF的活性 利用含有VEGFcDNA的腺病毒载体转染乳腺癌细胞 用以拮抗VEGF的促血管生成作用 用抗VEGF的核酶抑制VEGF的表达 使卵巢癌生长及血管生成减少的报告 针对其它的血管生成因子的治疗 如bFGF 缺氧诱导因子 HIF EGF PDGF PDECGF IGF Ets 1 HGF等的因子的治疗 Zhang等用VEGFsiRNA特异性地抑制VEGF的表达 成功地抑制小鼠卵巢癌上皮ID8细胞的增殖 TSP1是一种血管抑制因子 它可以抑制mmp9基因的激活 从而抑制肿瘤的生长 一般说来 肿瘤细胞能够通过抑制TSP1的表达来达到其指数增殖的目的 通常情况下 VEGF能够抵制TSP1的血管生长抑制作用 Filleur等用VEGFsiRNA转染肿瘤细胞 发现VEGFsiRNA抑制效应可以与分泌TSP1的肿瘤细胞协同作用 抑制肿瘤的生长 并且VEGFsiRNA能阻止TSP1耐受细胞的出现 并极大地抑制了这些细胞的生长速度 二 上调血管生长抑制因子用重组血管抑素cDNA输入消化道肿瘤可取得较好的治疗效果 用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和VEGF介导的血管生成 病毒载体介导的重组编码PF4的反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用 三 抑制细胞外基质和基膜降解以及抑制内皮细胞特异性粘附分子的作用用腺病毒载体介导的T1MP 1基因转染肿瘤细胞 瘤细胞产生的T1MP 1抑制了MMP 2 MMP 9的活性 使内皮细胞的迁移受到抑制 Gondi等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的反义uPAR和uPA治疗胶质瘤 明显抑制了肿瘤的血管生成 第五节 加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别 自杀基因治疗自杀基因 suicidegene 治疗思路就是人为地改变肿瘤细胞的状态 将一些 自杀基因 TK基因 CD基因和较新的细胞色素p450 2B1基因 转导入肿瘤细胞中 这些基因所表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质 而引起到杀伤细胞的作用 一 旁观者效应与机制1 旁观者效应 bystandereffect 几乎所有的自杀基因系统都具有旁杀伤效应 即不仅转导自杀基因的细胞可以被杀死 而且与其相邻的未转导自杀基因的细胞亦可被杀死 研究发现旁杀伤效应一般是1 10 即一个基因修饰细胞死亡时带动10个基因未修饰细胞死亡 由此可见 旁观者效应 明显扩大了自杀基因的杀伤作用 2 旁观者效应的可能机制 磷酸化的巯基通过缝隙连接在同类细胞间传递 自杀基因 TK GCV 介导的细胞死亡表现为凋亡 临近未转染细胞吞噬凋亡小体 而凋亡小体内含有GCV三磷酸代谢产物 自杀基因可使肿瘤从免疫抑制转变为免疫刺激 包括各种细胞因子释放和免疫细胞浸润的级联反应 死亡细胞中抗原暴露 被周围APC摄取而产生抗肿瘤免疫 二 靶向基因表达和治疗应用自杀基因进行基因治疗时 首先要求转染的自杀基因要有一定的表达效率 其次 导入的基因要局限于靶细胞 常用的病毒载体导入法能较好地解决这个问题 增加病毒载体靶向性的一种重要策略就是利用肿瘤特异性调控元件去调节自杀基因的表达 肿瘤细胞内具有特异性转录激活因子 能激活特定蛋白的转录表达 而转录激活的作用是通过结构基因上游的特异性调控序列起作用 正常细胞内无此类特定的转录激活因子 因此 当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制的外源性目的基因后 肿瘤细胞内的特异性调控序列可被激活 表达目的基因 从而达到靶向基因表达和治疗的目的 正常细胞则不能表达 在各种调控序列中 组织特异性启动子常被用作启动目的基因在靶组织中高度表达 如甲胎蛋白基因启动子 pAFP 癌胚抗原启动子 pCEA 白蛋白启动子 pALB 骨钙化蛋白启动子 pUL 前列腺特异抗原启动子 psA 等 如使用新型的载体KD1 SPB KD1是伴有代替表面活性蛋白B surfactantproteinBSPB 的E4促动子 在成熟 型肺泡上皮和支气管上皮癌中SPB促动子的活性受到限制 因为KD SPB中有E1A突变 因此它仅能作用于肺和支气管的癌细胞 KD1 SPB在肝癌治疗中抑制肿瘤生长 表明腺病毒载体在癌治疗中能针对组织特异性肿瘤具有选择性的复制能力 三 将 毒性 基因导入肿瘤细胞杀死肿瘤细胞这些基因通常编码的是一种酶 这种酶可使无毒的前药转化为有毒的代谢产物 从而使转导细胞死亡 因此通常也称为酶 前药系统 最近 Nagy等在实验兔中使用逆转录的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 Herpessimdexvirus thymidinekinaseHSV TK 作为自杀基因治疗卵巢癌能引起该肿瘤退化 HSV TK可使核苷类似物磷酸化 然后代替核苷整合到DNA链中 从而使细胞死亡 肿瘤细胞导入HSV TK后 高表达TK 使细胞内毒性产物集聚而死亡 在不到20 的肿瘤细胞导入TK后 用前药GCV会引起80 的肿瘤细胞死亡这是旁观者效应所引起的 我国学者颜子颖利用AFP基因上游调控序列构建了一种肝癌细胞特异表达的EB病毒复制子载体 成功地实现了肝癌细胞中基因转移的靶向性 由于脑的神经细胞已高度分化 只有肿瘤细胞处于活化分裂状态 因此脑肿瘤是自杀基因较理想的靶器官 对于脑肿瘤中最常见的神经胶质瘤的治疗中 HSV TK GCV首先由美国NFH的Ram及Calver小组于1992年报道 在动物实验及动物脑肿瘤中非常理想 于1992年7月获得FDA批准进入临床试验阶段 国内也有报道用大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 cytosinedeaminaseCD 自杀基因系统治疗胶质瘤 CD仅存在真菌与细菌中哺乳类动物无 CD可将胞嘧啶脱氨基变为尿嘧啶 可使5 Fc脱氨基转变为5 Fu 而5 Fu作为化疗药物抑制DNA合成 CD基因是第二个用于人体的肿瘤自杀基因 HSV TK GCV自杀基因系统还常常用于成神经管细胞瘤 脑膜转移瘤等脑肿瘤的治疗 此外 自杀基因治疗也普遍应用于肝癌 肺癌 结肠癌 甲状腺癌 腹膜癌等肿瘤的治疗中 它对那些恶性易复发 疗效差和无法根治的肿瘤是一种较为理想的治疗方法 四 自杀基因与免疫基因的联合治疗将产生更好的疗效研究发现单用HSV TK GCV治疗 可使肿瘤比对照组小5倍以上 而联用IL 2基因或IL 12基因能使肿瘤完全消失并抑制转移 将IL 2基因 GM CSF基因和HSV TK基因三者合用可取得更好的效果 IFN 基因与HSV TK GCV系统联合治疗 可使70 以上的鼠白血病肿瘤消退 并明显延长鼠成活时间 而单纯IFN 只延长鼠成活时间 不能使肿瘤消退 单纯HSV TK GCV只暂时抑制肿瘤的生长和略微延长鼠成活时间 自杀基因治疗对免疫功能的激发作用 诱导炎症细胞浸润 T细胞 单核细胞 中性粒细胞 诱导细胞因子的分泌 IL 1 TNF IL 1 IL 6 mRNA在治疗后第2天开始表达 而IFN GM CSF在治疗后第2天开始表达 到治疗后第4天仍有表达 其中以TNF 表达升高最明显 第六节提高化疗效应 耐药基因治疗肿瘤化疗中最难处理的问题之一就是出现瘤细胞对许多常用化疗药物产生抗药性和交叉抗药性 有些肿瘤开始敏感 但经过一段时间后出现耐药性 这种耐药性常表现为肿瘤细胞对多种结构不同 作用靶位不同 作用方式不同的抗肿瘤药物具有抵抗性 称为多药耐药 multidrugeresistance MDR 自1970年Bieuler等首次报道交叉耐药现象以来 针对肿瘤耐药基因治疗日益活跃 主要集中在两个方面1 MDR的形成机制2 如何利用MDR基因来抵制晚期肿瘤患者化疗时出现的骨髓抑制 研究发现 这种耐药性与肿瘤细胞的某些耐药基因相关 多药耐药基因1 MDR1 编码相对分子质量为170000的跨膜糖蛋白P gp P 170 具有药泵的作用 当其表达增高或功能异常增强时 能将肿瘤细胞内的药物 泵 出细胞外 使细胞能在高浓度的药物环境中生存 针对该基因的RNAi可以使MDR1基因的水平下调 提高细胞内的药物浓度 提高肿瘤细胞对化疗的敏感性 Nieth等通过anti MDR1 siRNA成功抑制了人胰腺癌细胞株 EPP85 181RDB 和胃癌细胞株 EPG85 257RDB 的MDR1基因及其表达产物 抑制效率达91 两种细胞对柔红霉素的耐药性抵抗分别降低了58 和89 表明此种siRNA也可以试用于肿瘤的治疗 通过提高细胞对抗肿瘤药物的敏感性来达到治疗肿瘤的目的 一些应用多药耐药基因 MDR1 转染保护骨髓造血细胞的基因治疗项目已进入临床试验阶段 如将针对化疗药物的MDR转染至肿瘤患者的骨髓造血干细胞 HemopoieticStimCell HSC 使其具有比肿瘤更强的化疗药物耐受力 可以提高临床化疗剂量和时间 而减轻化疗最主要的副作用 对骨髓细胞的损害 临床常用于骨髓未受侵犯的乳腺癌 卵巢癌和各种脑部肿瘤患者的治疗 因为这些肿瘤细胞中较少检测到内在MDR1的表达 而且即使接触MDR1的药物 其表达水平仍明显低于转基因的造血细胞表达水平 据报道 20例晚期乳腺癌或卵巢癌患者经此治疗有8例获完全缓解 9例获部分缓解 完全缓解中位时间为10个月 一些新的耐药基因 如突变的二氢叶酸还原酶 MDHFR 甲基鸟嘌呤甲基转移酶 MGMT 谷胱苷肽 S 转移酶 GST 醛脱氢酶 ALDH 等被用于肿瘤耐药基因的治疗 通过用耐药基因转染保护骨髓造血细胞是一种特殊方式的肿瘤基因疗法 用于克服化疗的骨髓抑制作用效果显著 临床应用潜力很大 在肿瘤治疗中多数抗癌药物是促进细胞凋亡的 而癌细胞的耐药是化疗中最棘手的问题 在报道中将BCl 2转入癌细胞则癌细胞变为耐药 目前从凋亡角度来研究肿瘤的耐药性 可能找到新的解决方法 多药耐药 MDR 的检测帮助临床选择有效的抗癌药物 胚胎型谷胱甘肽 S 转移酶 GsT 是肿瘤细胞产生耐药的一种标记 对顺铂类化疗药物产生耐药 用于肝癌 胃癌 胰腺癌 结肠癌 食道癌治疗 热休克蛋白 HSPs 是细胞受应激原刺激后产生的一组应激蛋白 与肿瘤发生 增殖及分化有关 按其分子量有3种类型 HPS27与肿瘤耐药和肿瘤分化有关 HPS60主要用于舌鳞癌 结肠癌 胰腺癌和乳腺癌的研究 具有预后意义 HPS90可能参与细胞凋亡 DNA损伤修复 P 糖蛋白 P gP 是多药耐药 MDR 基因的产物 是转膜蛋白 被称为 药物流出泵 或 膜泵糖蛋白 转膜蛋白是个活跃的转运者 排出细胞内毒物与药物 通过ATP供能 将已进入细胞内的药物从细胞内泵出到细胞外 降低细胞内抗癌药物的浓度 减少对细胞的毒性作用 P糖蛋白表达程度与耐药程度成正比 与化疗效果 生存期成反比 在原发性乳腺癌中P糖蛋白表达很低 但经过治疗后可升高 这可能是由于细胞选择性的耐受药物 一旦有P基因扩增 常伴有肿瘤进展 现已表明一些钙通道阻断剂 如硝苯吡啶 维拉帕米 异搏定和免疫抑制剂等均可转化MDR表型 抑制P糖蛋白的膜泵作用 增加癌细胞内化疗药物的积聚 使抗癌药物杀伤能力增强 P gP易产生耐药的抗癌药物主要是长春花碱 长春新碱类和阿霉素 DNA拓扑异构酶 Topo 在正常细胞DNA合成与分裂时起作用 是细胞周期S G2 M期中敏感而特异的标记 其含量高低与抗癌药物的作用呈正比 是抗癌药物的作用靶点 当肿瘤细胞Topo 表达下降产生对Topo 抑制剂类化疗药物 阿霉素及鬼臼乙叉甙等 产生耐药 其它的耐药预测物有 乳腺癌C erbB 2过表达对含有环磷酰胺 氨甲蝶呤和氟尿嘧啶的化疗方案耐药 N myc表达增强的小细胞肺癌和神经母细胞瘤对化疗缺乏反应并进展快速 Bcl 2耐药机制为抗凋亡作用 高表达者对多数抗癌药物 放射治疗耐受 因此这方面的免疫组化检测对肿瘤病人选择化疗方案和预后判断具有重要的临床意义 第七节肿瘤基因治疗研究面临的主要问题基因治疗是21世纪治疗恶性肿瘤的重要手段 一 基因导入的载体系统目前所采用的载体主要分为转染性和转导性载体 转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将DNA转染入细胞内 包括脂质体和基因枪等 转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞 转染的方法相对简易 抗原性弱但效率较低 而且基因表达的持久性不够 因此它在肿瘤基因治疗中的使用受到限制 转导法则效率高 作用持久 但抗原性较强 目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导 逆转录病毒是目前最为成熟 运用最广的进行基因转移的载体系统 迄今为止人类基因治疗的载体 约60 是用复制缺陷型的逆转录病毒 最广泛使用的是Moloney鼠白血病病毒MoMuLV 其生物学特性为 可感染分裂细胞 可整合到宿主染色体中 表达时间较长 优点 受体分布广泛 几乎存在所有的人类细胞上 因而对细胞的感