微生物限度检查作业指导书

文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 页页 码码1 10 微生物限度检查作业指导 书 实施日期实施日期2005 9 24 目的目的 建立微生物限度检查的标准操作规程 为微生物检验人员提供正确的操 作方法 范围范围 适用于辅料 内包材料和所有产品的微生物限度检查 职责 职责 检验人员对本规程的实施负责 参照标准参照标准 GB T4789 3 2003 GB T4789 15 2003 GB T4789 2 2003 内容内容 1概述概述 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原 辅料受到微生物污染程度 的一种检查方法 包括染菌量及控制菌的检查 供试品一般按批号随机抽样 抽样量应为检验用量 2 个以上最小包装单 位 的 3 倍量 以备复检 检验的全过程 均应严格遵守无菌操作 严防再污染 2仪器与用具仪器与用具 恒温恒湿培养箱 生化培养箱 恒温水浴 高压蒸汽消毒锅 电热恒温干 燥箱 试管 锥形瓶 量筒 培养皿 90mm 刻度吸管 研钵 托盘天平或 电子天平 镊子 剪刀 酒精灯 打火机 编号笔 75 酒精棉球 拖鞋 无 菌衣 裤 帽 口罩 以上玻璃器皿 镊子 剪刀等洗净 晾干 160 170 干烤 2h 备用 所有灭菌物品存放于第一缓冲间 不应超过 2 周即用毕 否则 应重新灭 菌 3培养基 试液配制培养基 试液配制 营养琼脂培养基 细菌用 孟加拉红培养基 虎红琼脂培养基 霉菌用 胆盐乳糖培养基 即 BL 用于大肠杆菌增菌培养 4 甲基伞形酮葡糖苷酸 MUG 培养基 用于大肠杆菌快速检查 麦康凯琼脂培养基 即 MacC 用 于肠道菌分离培养 蛋白胨水培养基 供靛基质试验用 磷酸盐葡萄糖胨水 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码2 10 培养基 供甲基红及 VP 试验用 枸橼酸盐培养基 供枸橼酸盐利用试验用 营养肉汤培养基 四硫磺酸钠亮绿培养基 TTB 沙门菌增菌用 胆盐硫乳琼 脂 DHL 或沙门 志贺菌属琼脂 SS 培养基 用于沙门菌分离培养 麦 康凯琼脂或曙红亚甲蓝琼脂培养基 大肠杆菌及沙门菌分离培养用 三糖铁琼 脂 TSI 斜面培养基 肠道菌初步鉴别用 的配制及灭菌方法参见中国药典 2000 年版一部附录 C 0 1 2 3 5 氯化三苯基四氮唑 TTC 溶液 供制备培养基用 氢氧化钾 试液 供作 V P 反应试剂 萘酚乙醇溶液 供作 V P 试剂 靛基质试 液 的配制及灭菌方法参见中国药典 2000 年版一部附录 C 稀释剂 0 9 无菌氯化钠溶液 无菌磷酸盐缓冲液 PH7 2 4操作过程操作过程 4 1试验前的准备试验前的准备 4 1 1将所有已灭菌的培养皿 锥形瓶 研钵 试管 吸管 量筒 稀释剂及 供试品等通过传递窗进入无菌室内 每次试验所用物品必须事先计划 准备足够用量 避免操作中出入 将全部包装去掉 编号 4 1 2开启紫外灯 30 分钟 或臭氧发生器 1h 和空气过滤装置 30 分钟 进行 空间灭菌处理 4 1 3操作人员用肥皂洗手 关闭紫外线杀菌灯 或臭氧发生器 进入缓冲间 换工作鞋 再用 0 1 苯扎溴铵 新洁尔灭 消毒液洗手或乙醇棉球擦手 穿戴无菌衣 帽 口罩 手套 4 1 4操作前先用乙醇棉球擦手 再用乙醇棉球 或碘伏棉球 擦拭供试品瓶 盒 袋等的开口处周围 待干后用灭菌的手术剪刀将供试品瓶 盒 袋 启封 启封后先检查包装内侧及周围有无生霉 长螨迹象 若经证实为 生霉 长螨即可判为不合格 无须继续检验 4 1 5定期检查无菌环境的空气是否符合规定 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码3 10 4 2操作操作 4 2 1 细菌 霉菌与酵母菌细菌 霉菌与酵母菌 4 2 1 1 以无菌操作 称取检样 25g ml 加入含 225ml 灭菌水的具玻塞锥形瓶 中 振摇 30min 即为 1 10 稀释液 4 2 1 2 用灭菌吸管吸取 1 10 稀释液 10ml 注入灭菌试管中 另用 1ml 灭菌 吸管反复吹吸 50 次 使霉菌孢子充分散开 4 2 1 3 取 1 支 1ml 灭菌吸管吸取 1 10 均匀供试液 1ml 沿管壁加入装有 9ml 灭菌稀释剂的试管中 混匀即 1 100 供试液 以此类推 根据供 试品污染程度 可稀释至 1 103或 1 104 细菌选择两至三个稀释度 霉菌选择三个稀释度 4 2 1 4 在进行 10 倍递增稀释的同时 以该稀释级吸管吸取每级稀释液各 1ml 置每个灭菌平皿中 每稀释级注 2 个平皿 另取 1 支 1ml 吸管吸取稀释 剂各 1ml 注入 2 个平皿中 作为阴性对照 4 2 1 5 将融化并冷至约 45 的培养基注入上述各个平皿约 15 ml 以顺时针或 反时针方向快速转动平皿 勿使培养基溢出 使供试液与培养基混匀 放置 待凝 4 2 1 6 将已凝固的平板倒置于适宜温度的培养箱中 培养 细菌于 36 1 培养 48 2 小时 霉菌 酵母菌于 25 28 培养 3 天后开始观察 共 培养观察 5 天 4 2 1 7 将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计 以 透视光衬以暗色背景 仔细观察 计数 4 2 2 大肠杆菌大肠杆菌 取胆盐乳糖培养基 3 份 每份 100ml 2 份分别加入规定量的供试液 其中 1 份加入对照菌 50 100 个作阳性对照 第 3 份加入与供试液等量的稀释液作 阴性对照 培养 18 24 小时 必要可延至 48 小时 阴性对照应无菌生长 取 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码4 10 上述 3 份的培养物各 0 2ml 分别接种至 5ml MUG 培养基管内培养 分别于 5 小时与 24 小时时 取未接种的 MUG 培养基管作本底对照 将各管置 365nm 紫 外光下观察 阳性对照管呈现荧光 MUG 阳性 供试液的 MUG 管呈现荧光 MUG 阳性 无荧光 MUG 阴性 然后加数滴靛基质试液于 MUG 管内 液面 呈玫瑰红色为阳性 呈试剂本色为阴性 当阴性对照呈阴性 阳性对照正常生长 供试液胆盐乳糖培养基培养液澄 明 并证明无菌生长 判未检出大肠杆菌 供试液 MUG 阳性 靛基质阳性 判检出大肠杆菌 MUG 阴性 靛基质阴性 判未检出大肠杆菌 如 MUG 阳性 靛基质阴性 或 MUG 阴性 靛基质阳性 均应取供试液 胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板 培养 18 24 小时 如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长 判未检出大肠杆菌 或有菌落生长 应挑选 2 3 可疑菌落作靛基质试验 甲基红试验 M 乙酰甲基甲醇生成试验 V P 枸橼酸盐利用试验 C 及革兰染色 镜检 按下表判断结果 MUG I 曙红亚甲蓝琼脂IMVic结果 检出大肠杆菌 未检出大肠杆菌 无菌生长未检出大肠杆菌 有菌生长 检出大肠杆菌 有菌生长 检出大肠杆菌 注 如 出现 或 出现 均应重新分离菌株 再 作 MUG I 和 IMVic 试验 革兰氏阴性杆菌 4 2 3 沙门菌 沙门菌 取营养肉汤培养基 3 份 每份 100ml 2 份分别加入规定量的供试液 其中 1 份加入对照菌液作阳性对照 第 3 份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码5 10 培养 18 24 小时 阴性对照应无菌生长 取其余 2 份培养物各 1 ml 分别接种 于四硫磺酸钠亮绿培养基 10 ml 中 培养 18 24 小时 分别划线接种于胆盐硫 乳琼脂 或沙门 志贺菌属琼脂 培养基和麦康凯琼脂 或曙红亚甲蓝琼脂 培养基的平板上 培养 18 24 小时或延至 40 48 小时 当阳性对照的平板呈 现阳性菌落时 供试品的平板无菌落生长 或有菌落但不同于下表所列特征时 可判为未检出沙门菌 培养基菌 落 形 态 胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色 半透明 菌落中心带黑色或全黑色或无 色 沙门 志贺菌属琼 脂 无色至淡红色 半透明或不透明 菌落中心有时带黑褐 色 曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色 透明或半透明 光滑湿润的圆形菌落 麦康凯琼脂无色至浅橙色 透明或半透明 菌落中心有时为暗色 如供试品平板生长的菌落特征有与上表所列形态特征相符或疑似者 均应 挑选 2 3 个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上 阳性对照同时接种该培 养基 培养 18 24 小时后 阳性对照的斜面应为红色 底层为黄色 硫化氢阳 性 而供试品的疑似菌斜面未见红色 底层未见黄色 可判为未检出沙门菌 否则 应继续做靛基质试验 脲酶试验 赖氨酸脱羧酶试验 动力检查 血清靛基质试验 脲酶试验 赖氨酸脱羧酶试验 动力检查 血清 凝集试验 凝集试验 5 注意事项注意事项 5 1供试品在检验之前 应保存在阴凉干燥处 勿冷藏或冷冻 以防供试品内 污染菌因保存条件不妥引起致死 损伤或繁殖 供试品在检验之前 应保持原包装状态 严禁开启 包装已开启的样品不 得作为供试品 5 2除另有规定外 供试品制备成供试液后 应在均匀状态取样 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码6 10 制成供试液后 应在 60 分钟内注皿操作完毕 5 3配制后的培养基应及时灭菌 避免细菌繁殖 培养基不应有沉淀 如发生 沉淀 应趁热过滤 5 4制备妥的培养基应在冷暗处保存 放置时间不能过长 锥形瓶的琼脂培养 基保存时间最长不能超过一个月 以免水分散失染菌 5 5勿用电炉直接融化琼脂培养基 以免营养成分过度受热而破坏 5 6注皿时培养基应在 45 1 高于 45 时易造成细菌受损或致死 低于 45 时易凝固 因此使用前应水浴保温 5 7细菌 霉菌与酵母菌及控制菌必须做阴性对照试验 目的 测试检验全过 程无菌技术的可靠性 控制菌必须做阳性对照试验 目的 检查供试品 是否对控制菌生长产生干扰作用 同时检查培养条件是否适宜 5 8阳性对照试验操作必须与供试品检验操作严格分开 避免交叉污染 5 9做完试验后 用消毒液清洁 开紫外灯照射 30 分钟 或臭氧发生器 1h 6 结果判定结果判定 菌数报告及结果判定按中国药典 2005 年版二部附录 C 附件 1 霉菌与酵母菌检验程序 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码7 10 附件 2 细菌检验程序 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码8 10 附件 3 大肠杆菌检验程序 供试液 供试品 胆盐乳糖培养基 文件编号文件编号 文件版本号文件版本号 负责部门负责部门 品管部 微生物限度检查作业指导 书 页页 码码9 10 附件 4 沙门菌检验程序 MUG I MUG I MUG I MUG I 判检出大肠杆菌判未检出大肠杆菌 报告报告 EMB 或麦康凯琼脂 无菌落生长有菌落生长 判未检出大 肠杆菌 普通肉汤琼脂斜面 报告 革兰氏染色镜检 靛基质试验 甲基红试验 V P 试验 枸橼酸盐 报告