实验步骤- Western bloting实验流程 (2012-5临床医

1 Western blotting 实验流程实验流程 实验流程共分为实验流程共分为 6 6 步步 1 1 待测蛋白的准备 待测蛋白的准备 2 2 蛋白电泳 蛋白电泳 3 3 转膜 转膜 4 4 抗体结合 抗体结合 5 5 曝光 曝光 6 6 灰度值统计分析 灰度值统计分析 一 待测蛋白的准备一 待测蛋白的准备 1 细胞蛋白的提取 细胞蛋白的提取 1 拿出六孔培养板 去培养液 PBS 洗细胞两遍 根据细胞密度每孔加 50 100 l 细胞 裂解液 含 1 的蛋白酶抑制剂 PMSF 现用现配 冰上放置 10 分钟裂解 2 将培养板置于冰上 用细胞刮挂下细胞 每孔刮一分钟左右 刮不同孔细胞需用 PBS 或水冲洗细胞刮 洗后甩干 收集裂解液于 1 5ml EP 管中 置于冰上裂解 20 分钟 期间 需用振荡器振荡混匀 3 次 每次 15 秒左右 3 12000rpm 4 冷冻离心 5min 左右 收集上清置于新 EP 管 存于 80 2 BCA 法蛋白溶液浓度测定 具体步骤按试剂盒说明书 法蛋白溶液浓度测定 具体步骤按试剂盒说明书 1 配制 BCA 工作液 打开 37 恒温箱预热加温 取出 BCA 标准品与蛋白样品解冻 配 BCA 工作液 A B 50 1 A 液总量 8 个标准蛋白 待测蛋白数量 200 l B 液 总量 8 个标准蛋白 待测蛋白数量 4 l 配好后混匀 2 配制 BCA 标准品与标准曲线 用 PBS 稀释好标准品 按说明书将标准品加入到 96 孔板中 再补加 PBS 到一样体积 3 配制蛋白样品 每孔加入 5 l 蛋白原液 补加 PBS 稀释 稀释可节省蛋白 记住稀 2 释倍数 蛋白较多时也可不稀释直接加蛋白原液测 蛋白孔可做 2 3 个平行孔 测量时取 平均值较准 4 加入 BCA 工作液 每孔各加 200 l 已配好的工作液 盖上板盖混匀 30 秒 37 孵 育 30min 放好蛋白样品 5 测蛋白浓度 打开酶标仪预热 10 分钟以上 孵育完后取出 96 孔板冷却到室温 用移 液枪去除小气泡 用纸巾擦干 96 孔板板度水珠 调节酶标仪波长 放入打印纸 打开 96 孔板板盖 在 570nm 波长下读取数值 空白孔可设可不设 具体按酶标仪操作说明 可 以测几次选取 6 计算浓度 用 EXCELL 表格制作标准直线方程 计算待测蛋白浓度 若稀释测量的 记住要乘以稀释倍数才是最终蛋白浓度 然后以每个条带最低浓度那组蛋白为标准计算各 组蛋白上样体积与细胞裂解液 RIPA 的补加体积 注意 标准曲线 R 平方值在 0 99 以上 才可用 每孔蛋白上样量要 8 微克以上才行 注意 用移液枪加液体时可沿 96 孔板的孔壁加 避免产生气泡影响结果 二 蛋白电泳二 蛋白电泳 一共分为一共分为 5 步 步 1 试剂配制 试剂配制 2 配胶 配胶 3 蛋白处理蛋白处理 4 加样 加样 5 跑电泳 跑电泳 1 试剂配制试剂配制 10 SDS SDS 粉剂 10g 蒸馏水 100ml 磁珠搅拌混匀 常温放置 室温过低 容易出现絮状沉积 需加热摇 匀 30 丙烯酰胺 丙烯酰胺 14 5g 避光磁珠搅拌溶解 3 N N 亚甲基甲叉双丙烯酰胺 0 5g 盛于棕色瓶中 4 保 蒸馏水 50ml 存 一个月有效期 10 过硫酸铵 过硫酸铵 0 1g 蒸馏水 1 ml 置于 EP 管摇匀 4 避光保存 3 日有 效期 现用现配最好 5 电泳缓冲液 Tris 碱 15 1g 甘氨酸 94g 10 SDS 5g 磁珠搅拌混匀 常温放置 使用时用 蒸馏水 1000ml 蒸馏水稀释至 1X 其它 1 5M Tris PH8 8 1M Tris PH6 8 均用试剂公司产品 常温放置 2 配胶配胶 检漏 洗干净玻璃板 不可用刷子刷 上面放好制胶架 板槽放好长条海绵胶 用 板夹加紧两块玻璃板 注意两块玻璃板的正反面及左右 底部是否对其 上下是否颠倒 否则容易漏胶 将板夹固定在板架上 特别注意 要将玻璃板底部在长条海绵胶上用力压 一压 使其紧贴海绵胶 否则极易漏胶 组装好后用枪灌满水检漏 待一段时间后不漏水 即可将水倒出并用纸或布吸干边角处 配置 12 分离胶 例如 按下述方法配制 10ml 量 可灌两块胶 做大分子蛋白 时可配 10 等低浓度胶 10 过硫酸铵与 TEMED 是凝胶试剂 应最后加 加完后立刻灌胶 蒸馏水 3 3ml 30 丙烯酰胺 4ml 1 5M Tris 2 5ml 用 5L 移液枪充分混匀 10 SDS 100 l 10 过硫酸铵 100 l TEMED 4 l 灌分离胶 用 5L 移液枪将配置好的分离胶 沿玻璃板壁边缘 加入两块玻璃板夹 4 层中 液面大约致玻璃板的 3 4 处 约 3 8ml 两块胶最好一致 再用无水乙醇加满至玻 璃板上缘来压胶 凝胶 等待约 30 60 分钟 出现明显的分界线 代表分离胶已经完全凝固 将整个 玻璃板架抬起 倾倒上层的乙醇 灌入蒸馏水冲洗一次 倾斜胶架倒出水后用纸或布吸干 边角处 凝胶时间与温度相关 冬天时间稍长 最长约 60 分钟 夏天时间稍短 最短 30 分钟亦可 放平玻璃板架 配制浓缩胶 按下述方法配制 6ml 量 蒸馏水 4 1ml 30 丙烯酰胺 1 0ml 1 0 M Tris 0 75ml 用 5L 移液枪充分混匀 10 SDS 60 l 10 过硫酸铵 60 l TEMED 6 l 灌浓缩胶 将齿梳洗干净并擦干 用 5L 移液枪将配置好的浓缩胶 沿玻璃板壁边 缘 加入两块玻璃板的夹层中 添加在分离胶上 加满至玻璃板上缘 注意避免灌入气泡 然后将齿梳插入 观察孔底是否有气泡 有气泡应拔出重灌 注意 由于浓缩胶凝固较快 因此 混匀时间不宜太长 要尽快加入玻璃板内 凝胶 等待约 30 60 分钟 齿梳边缘出现浓缩胶的界限 代表浓缩胶已经完全凝固 凝胶时间亦和环境温度有关 具体见上 注意 低温保存的配胶试剂用完后应及时放回冰箱保存 3 上样蛋白处理及保存上样蛋白处理及保存 解冻 取 5 的蛋白上样缓冲液与细胞裂解液 RIPA 需要放于 20 冰箱中保存 使用前解冻揺匀 配平蛋白浓度 从 80 冰箱中取出蛋白上清液 室温解冻 按测好的蛋白数据从各 组蛋白中取出相同蛋白量 至少 8 微克以上 的蛋白上清液 按蛋白数据以最低浓度组蛋 白为标准向各组高浓度蛋白加入相应的细胞裂解液 RIPA 配平至一致浓度 然后按 4 1 加 入 5 的蛋白上样缓冲液 用混匀器充分混匀 举例 取 20 的蛋白上清液 加入 5 的 5 的蛋白上样缓冲液 蛋白变性 将上述混匀后的液体 放入 90 以上沸水中 煮 5min 使蛋白变性 5 煮蛋白时 需要将装有蛋白液体的离心管 放入凿好合适孔径的水上漂浮载体上 再放 入盛好水的电磁炉中 使离心管底部的蛋白液体受热变性 同时又保持管口朝上不会进水 导致浓度改变 煮的过程 离心管盖容易被胀开 可打开电磁炉锅盖 温度调到 120 来 有效避免 离心 将煮好的蛋白液体常温冷却后 轻度离心到管底 如 2000rpm 30s 最后 放入 20 冰箱中保存待用 4 加样加样 加电泳液 卸掉玻璃板夹 取出玻璃板 将玻璃板放入电泳架上 注意 将玻璃板 放进电泳架时 一定要向下压紧 使其底面贴紧 再上好压扣 否则容易漏液 注意小玻 璃板朝内 大玻璃板朝外 将上好玻璃板的电泳架放入电泳槽中 红对红 黑对黑 电泳 架内倒满新配置的 1X 电泳缓冲液 电泳架外 即电泳槽内 倒入回收的或新的电泳缓冲 液 一般液面至玻璃板的一半高度即可 电泳槽外有刻度 2 块胶一半高度左右 4 块胶加 满 上样 从 20 冰箱中 取出配置好的蛋白样品液体和 MARK 样品 拔掉齿梳 将 点样架放在电泳架上 用 10 l 的移液枪 按以下顺序加样 例如 MARK12345678MARK 6 l18 l18 l18 l18 l18 l18 l18 l18 l3 l 5 跑电泳跑电泳 拿掉点样架 盖上电泳槽盖 注意 红对红 黑对黑 将盖上的插头 插入电泳仪 中 注意 红对红 黑对黑 先用恒压 80V 待样品跑至分离胶后 MARK 开始分离出多条带 时间大约 20min 再转成恒压 120V 注意 样品在浓缩胶内会慢慢由宽带压缩成窄带 MARK 应该会压缩 成一条细线 转成恒压 120V 后 待样品跑至分离胶底部后 时间大约 60min 即可停止电泳 注意 每孔的样品应该在各自的泳道 互不相扰 样品底部应该有一条红色线状条带 3 转膜转膜 一共分为一共分为 4 步 步 1 试剂配置试剂配置 6 2 三明治三明治 夹层夹层 3 转膜转膜 4 染色染色 1 试剂配置及转膜准备试剂配置及转膜准备 1 1X 转膜缓冲液 Tris 碱 5 8g 甘氨酸 2 9g SDS 0 37g 充分磁珠混匀后 4 下冷却 1 小时以 上 甲醇 200ml 未加甲醇可室温保存 加入甲醇后需 4 蒸馏水 800ml 保存 可用 2 到 3 次 2 剪切 PVDF 膜 用剪刀 剪切 PVDF 膜 大于滤纸和胶 用甲醇浸泡 10 秒钟以 上 活化 PVDF 膜 3 剪切滤纸 用剪刀 剪切滤纸 大于胶 4 冰浴箱 用泡沫箱装入水 冰和冰袋 为保证低温 需提前做好 5 3 TBS T TBS 1000ml Tween20 3000 l 磁珠搅拌混匀 PH 调到 7 5 左右 6 10 丽春红 S 染色液 丽春红 S 2g 磺基水杨酸 30g 磁珠搅拌混匀 也可从试剂公司购买现 成 三氯乙酸 30g 的 7 考马斯亮蓝 G250 染色液 G250 0 25g 甲酸 50ml 100ml 甲酸 乙酸 水为 7 5 1 4 乙酸 10ml 磁珠搅拌混匀 蒸馏水 40ml 2 三明治三明治 夹层夹层 将分离胶 PVDF 膜 滤纸 和转膜架 绝缘胶布浸入转膜缓冲液中 10 分钟 按下列顺序做好 三明治 负极 正极 黑 膜 膜 白 正 反 面 面 海绵垫 滤纸 胶 膜 滤纸 海绵垫 大小顺序为 膜 滤纸 胶 厚滤纸每边各 2 层即可 薄滤纸每边各 3 层 具体方法 将转膜夹打开使黑的一面保持水平 泡在转膜缓冲液中 在上面垫一张 海绵垫 在垫子上垫两层滤纸 铲胶时用胶铲撬开小玻璃板 将浓缩胶轻轻刮去 用水冲 一下胶铲 把分离胶的四边先起一下 然后小心剥下分离胶盖于滤纸上 要避免把分离胶 铲破 用手调整使其与滤纸对齐 轻轻用胶铲擀去气泡 接着将膜盖于胶上 要盖满整个 胶 膜需剪好切角标记正面 并除气泡 在膜上盖 2 张滤纸并除去气泡 最后盖上另一张 海绵垫 合上转膜夹 3 转膜转膜 将做好的 三明治 放入转膜槽内 黑对黑 加入预冷的转膜缓冲液 并将转膜 槽放入冰浴箱中 盖上转膜槽的盖子 红对红 黑对黑 将盖子的电极插入电泳仪 红对 红 黑对黑 冰浴下 用恒压 100V 转膜 90min 注意 注意 根据目的蛋白分子量大小来设定转膜 时间 蛋白分子量越大 转膜时间越长 如 蛋白分子量 60 以下转膜 90 分钟 60 以上转 膜 120 分钟 200 以上转膜 180 分钟 使用 0 22 m 孔径 PVDF 膜不会转过去 时间越长 越好 8 转膜结束后 将膜夹出 放入 TBS T 中 4 染色 转膜条件稳定后可省略 染色 转膜条件稳定后可省略 方法 转膜结束后 将膜放入 10 丽春红染色液中 摇床摇 10 分钟染色 将胶置于考 马斯亮蓝染色液中 染色 20 分钟以上 膜染色完后 回收丽春红 用水或 TBS T 轻轻冲 洗膜上的染液 观察膜上是否有转上蛋白条带 胶染色完后 回收考马斯亮蓝染色液 用 考马斯亮蓝脱色液或水来脱色 胶脱色得较透明时可观察胶上是否会残留有未转上的蛋白 条带 注意 丽春红染色灵敏度低 但可逆 考马斯亮蓝染色灵敏度高 但不可逆 若转 膜不充分时可不必往下做 4 抗体结合抗体结合 一共分一共分 3 3 步 步 1 试剂配制试剂配制 2 蛋白封闭蛋白封闭 3 一抗及二抗孵育一抗及二抗孵育 1 试剂配制试剂配制 5 封闭液 封闭脱脂奶粉 5g TBS T 100ml 充分混匀后 4 保存 牛奶易变质 3 天有效期 最好现用现 配 3 TBS T TBS 1000ml Tween20 3000 l 磁珠搅拌混匀 PH 调到 7 5 左右 一抗封闭液 一抗稀释液 一抗 移液枪充分混匀 配成 1 300 500 内参封闭液 一抗稀释液 内参 移液枪充分混匀 配成 9 1 300 500 二抗封闭液 5 封闭液 二抗 博士德 移液枪充分混匀 配成 1 4000 6000 按说明书为准 2 蛋白封闭蛋白封闭 转膜后 将膜放入 TBS T 中 用摇床揺洗 2 次 每次 5 分钟 将膜放入培养皿中 加入 5 封闭液 摇床上慢摇封闭 1 到 2 小时 3 一抗 内参及二抗孵育一抗 内参及二抗孵育 标记 将膜取出后放入 TBS T 中去除封闭液 膜正面朝上 按照 MARK 标记用刀 或剪刀切开目的条带和内参条带 并在条带左上角剪好切角 用铅笔标上抗体名称 封袋 将目的条带和内参条带分别用密实袋装好 用镊子夹住膜的边使膜的边贴紧 小袋子的边 可以节省一抗的用量 用封口机封好 3 边 分别加入一抗封闭液和内参封闭 液 每个约 2ml 左右 排清液体里面的气泡 再用封口机封好开口处 注意可封压几次 以防漏液 孵育 将封好口的密实袋放于 4 冰箱中过夜 第二天放入摇床上室温慢摇复温 1 到 2 小时 回收一抗与洗膜 复温后再将密实袋剪开一角 挤出一抗来回收 一抗可回收使用 5 到 10 次 一个月左右有效期 用镊子将膜夹出 放入 TBS T 中 不同条带可一起放 用摇床揺洗 5 次 每次 5 分钟 二抗孵育 将目的条带和内参条带分别放入培养皿中 加入二抗封闭液 每个约 7ml 将培养皿置于摇床上室温慢摇 1 小时左右 孵育完后二抗可回收使用 1 到 2 次 三 日内 因牛奶易变质 现用现配最好 洗膜 将膜夹出 放入 TBS T 中 不同条带可一起放 用摇床快揺 5 次 快摇可有 效去除背景 每次 5 分钟 五 曝光 全暗房内操作 五 曝光 全暗房内操作 一共分为一共分为 2 2 步 步 1 显色显色 2 胶片曝光胶片曝光 10 1 显色显色 准备好实验用品 发光剂要置于冰盒内 胶片要避光放置 进入暗房后锁好门 关 上门帘 打开洗片机预热 关灯看是否漏光 用纸巾擦干净暗盒胶膜内部 把膜置于干净培养皿中 正面朝上 关灯用剪刀剪取 合适大小的胶片 一张可对半剪开用 置于抽屉中 开红灯 用 1L 移液枪 按说明书加入 ECL 试剂 A 液 B 液 1 1 各加 600ul 左 右到培养皿中 将发光液混匀后均匀涂在膜的正面上