免疫组化步骤

免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 一 固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构 防止组织自溶 有必要对细 胞和组织进行固定 固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固 终止或抑制外源 性和内源性酶活性 更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性 使水溶 性抗原转变为非水溶性抗原 防止抗原弥散 不同抗原 其稳定性也不相同 因而对固定剂的耐受性差异较大 二 固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多 性能各异 在固定半稳定性抗原时 尤其重视固定剂的选择 介绍如下 1 醛类固定剂 双功能交联剂 其作用是使组织之间相互交联 保存抗原于 原位 其特点是对组织穿透性强 收缩性小 有人认为它对 IgM IgA J 链 K 链和 链的标记效果良好 背景清晰 是常用的固定剂 1 4 多聚甲醛为我们常用固定剂 2 Bouin s 液 该固定液为组织学 病理学常用固定剂之一 对组织穿透力较强而收缩性较小 比单独醛类固定更适合免疫组化染色 Kayhko 认为用于标记 B 细胞的 J 链较 好 但 Bullock 则认为它可导致 Igg 重链变性 故必需加大第一抗体的浓度 2 丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂 其作用是沉淀蛋白质和糖 对组织穿 透性很强 保存抗原的免疫活性较好 但醇类对低分子蛋白质 多肽及胞浆内 蛋白质保存效果较差 解决的办法是和其它试剂混合使用 如加冰醋酸 乙醚 氯仿 甲醛等 丙酮的组织穿透性和脱水性更强 常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定 保存抗原性较好 平时 4 C 低温保存备用 临用时 只需将涂片或冰冻切片 插入冷丙酮内 5 10min 取出后自然干燥 贮存于低温冰箱备用 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液 用于免疫组化的固定剂种类很 多 不同的抗原和标本需经过反复试验 选用最佳固定液 迄今尚无一种标准 固定液可以用于各种不同的抗原固定 而且同一固定液固定的组织 免疫组化 染色标记结果可截然不同 选择最佳固定液标准是 最好地保持细胞和组织 的形态结构 最大限度地保存抗原的免疫活性 一些含重金属的固定液在免 疫组化技术中是禁用的 实际经验告诉我们 中性缓冲福尔马林 或多聚甲醛 是适应性较广泛的固定液 但固定时间不宜过长 必要时 可作多种固定液对 比 从而选出理想的标准固定液 固定组织时应注意 应力求保持组织新鲜 勿使其干燥 尽快固定处理 组织块不易过大过厚 必须小于 2cm 1 5cm 0 3cm 尤其是组织块厚度必 须控制在 0 3cm 以内 固定液必须有足够的量 在体积上一般大于组织 20 倍以上 否则组织中心固定不良影响效果 组织固定后应充分水洗 去除固 定液造成的人为假象 石蜡组织标本处理过程 1 取材 将动物 如大小鼠 断颈处死后迅速取出所要组织 然后裁成大小 为 1cm 1cm 0 5cm 剔除组织上的脂肪和钙化 将组织放入 PBS 缓冲液中洗 涤 直至组织上无血渍为止 2 固定 将组织置于 4 多聚甲醛固定液中 4 固定 固定时间和组织厚度成 正比 每 1mm 一小时 3 脱水 固定后的组织经 PBS 缓冲液洗涤后 浸泡 30 分钟 3 次 放入乙醇 中 4 度剃度脱水 1 70 乙醇 4 3 4h 2 80 乙醇 4 3 4h 3 90 乙醇 4 2 3h 4 95 乙醇 4 2 3h 5 95 乙醇 4 1 2h 6 100 乙醇 4 1 5h 7 100 乙醇 4 1 5h 8 二甲苯 4 0 5 1h 9 二甲苯 4 0 5 1h 10 石蜡 60 1h 11 石蜡 60 2h 以上全过程为 18 24h 也可在室温内使用自动脱水机代替 如组织块小 直径小于 0 5cm 可用快速石蜡包埋切片 全过程只需 4h 左右 有些组织在切 片时易碎 如肝脏 在脱水时可适当缩短脱水时间 4 浸蜡 将组织浸入液态石蜡中 2 小时 2 次 严格控制浸蜡温度 60 65 为宜 防止温度过高导致组织蛋白丢失 5 模具包埋 待蜡完全凝固后 4 保存 6 切片 要求刀片锋利 切片时尽量避免刀痕与皱折 切片投入 50 左右水浴 中 若展片困难时可适度加入几滴乙醇 待完全展开后将其黏附在玻片中央 7 烤片 60 烤片 30 分钟 或 37 恒温箱过夜 烤完后切片标本可长期保存 免疫组化的试剂准备 最重要的是选择好一抗 二抗或者还有三抗 注意抗体的特异性 效价和 交叉反应 其他常用试剂有 1 0 01M pH7 4 的磷酸盐缓冲生理盐水 PBS 稀释抗体和洗片子用 2 清洁液 纯水 洗玻片用 3 多聚赖氨酸处理载玻片 防止脱片 4 固定液 4 多聚甲醛或冷丙酮等 5 15 30 蔗糖 组织脱水用 6 梯度酒精脱水 二甲苯透明 石蜡包埋 或者 OCT 包埋做冰冻切片 7 抗原修复液 枸橼酸缓冲液 pH6 0 或 PBS 8 活化剂 EDTA 或者 Triton X 100 9 1 10 牛血清清蛋白 BSA 封闭液 10 H2O2 灭活内源性过氧化物酶 11 显色液 根据你做的酶来选择 如果是 HRP 就用 DAB 如果是 AKP 就 用 NBT BCIP 免疫荧光则不需要 12 封片剂 免疫组化实验步骤 工作原理 SABC 是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的 用以显示组织和细胞中 抗原分布 链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质 分子量 47000 同亲 和素一样 对生物素分子有极高的亲和力 是一般抗原抗体亲和力的一百万倍 亲和素是一个碱性蛋白质 IP 10 经改造后可以转变成中性蛋白质 链霉 亲和素等电点接近中性 IP 6 0 6 5 对组织和细胞的非特异吸附很低 基于 链霉亲和素的免疫组化方法背景很低 SABC 即 StreptAvidin Biotin Complex 根据研究 SABC 大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十 个左右的链霉亲和素所构成的复合物 大量的酶将保证 SABC 具有很高的敏感 性 SABC 兼具高敏感性 低背景和操作简便的优点 所需试剂 推荐您使用本公司免疫组化试剂盒 1 5 BSA 封闭液 12ml 用于组织切片的封闭 2 二抗 12ml 亲和纯化抗体 标记长臂生物素 山羊抗小鼠 IgG 或 IgM 或 兔 IgG 3 SABC 12ml 链酶亲和素 生物素 过氧化物酶复合物 您还需要的试剂 1 粘片剂 APES 或 POLY L LYSINE 博士德公司有售 2 0 02 M PBS pH7 2 7 6 配法 1000ml 蒸馏水中加氯化钠 8 5g Na2HPO4 2 8g NaH2PO4 0 4g 如果用的是含水磷酸盐 应加上分子式中水的含量 3 0 01M 枸橼酸盐缓冲液 1000ml 蒸馏水中加枸橼酸三钠 C6H5Na3O7 2H2O 3g 枸橼酸 C6H8O7 H2O 0 4g 4 DAB 显色试剂盒 博士德公司有售 免疫组化染色程序的选择 用户需根据抗原 抗体的特点确定程序 多数情 况下要先比较各程序染色结果 A 程序 石蜡切片热修复抗原程序 适于核抗原 易被固定破坏的抗原 B 程序 石蜡切片酶消化程序 适于被固定遮避的抗原 C 程序 石蜡切片酶不消化 修复程序 适于稳定的抗原 D 程序 细胞涂片 冰冻切片染色程序 A 石蜡切片微波修复抗原染色程序 1 载玻片防脱片剂处理 可选择 APES 或 Poly Lysine 捞片后置烤箱 58 60 30 60 分以使切片紧密粘附 2 切片常规脱蜡至水 3 30 H2O2 1 份 蒸馏水 10 份混合 室温 5 10 分钟以灭活内源性酶 蒸馏水 洗 3 次 4 热修复抗原 将切片浸入 0 01M 枸橼酸盐缓冲液 PH6 0 电炉或微波炉 加热至沸腾后断电 间隔 5 10 分钟后 反复 1 2 次 冷却后 PBS pH7 2 7 6 洗涤 1 2 次 5 滴加 5 BSA 封闭液 室温 20 分钟 甩去多余液体 不洗 6 滴加适当稀释的一抗 小鼠或兔 IgG 37 1 小时左右或 20 时 2 小 时左右 也可 4 过夜 PBS pH7 2 7 6 洗 2 分钟 3 次 一抗的稀释度 孵育时间和温度与染色强度 背景有直接关系 一般来说 阳性染色强度不够 时 可提高一抗浓度和延长孵育时间 背景过高时 可降低一抗浓度和缩短孵 育时间 7 滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG 或兔 人 IgG 20 37 20 分钟 PBS pH7 2 7 6 洗 2 分钟 3 次 8 滴加试剂 SABC 20 37 20 分钟 PBS pH7 2 7 6 洗 5 分钟 4 次 9 DAB 显色 使用 DAB 显色试剂盒 AR1022 取 1ml 蒸馏水 加试剂盒中 A B C 试剂各 1 滴 混匀后加至切片 室温显色 镜下控制反应时间 一般在 5 30 分钟之间 也可自配显色剂显色 蒸馏水洗涤 10 苏木素轻度复染 脱水 透明 封片 显微镜观察 B 石蜡切片酶消化程序 以下面的步骤代替 A 程序中的第 4 步 滴加复合消化液 博士德有售 5 10 分 钟 蒸馏水洗 3 次 也可以使用 0 1 的胰蛋白酶作消化液 C 石蜡切片酶不消化 修复程序 对于不需要微波修复或消化的抗原 省略 A 程序中的第 4 步即可 D 血涂片 细胞和 冰冻切片染色程序 1 载玻片经防脱片剂处理 Poly L Lysine 2 抗凝血经分层离心后涂片 培养细胞也可涂片或贴片生长 冰冻切片室温风 扇吹干 3 固定方案首选 4 多聚甲醛或 10 福尔马林固定 30 分钟 对不能耐受甲醛固 定的抗原 纯丙