分子生物学-基因治疗完整版本.ppt

基因治疗 生化学院遗传教研室阿周存 一 基因治疗的概念 1990人类第一例基因治疗获得成功 1966年 Lederberg提出基因治疗概念 基因治疗 genetherapy 将正常基因植入靶细胞代替遗传缺陷的基因 或关闭 抑制异常表达的基因 以达到预防和治疗疾病的一种临床治疗技术 人类疾病治疗的重大突破 与传统的方法相比较 从根本上消除遗传病因 二 基因治疗类型和途径 生殖细胞基因治疗 germinalgenethrapy 体外 exvivo 间接基因治疗 体细胞基因治疗 somaticgenethrapy 1 类型 2 途径 体内 invivo 直接基因治疗 1 基因矫正 原位修复缺陷基因 原位替换 同源重组 2 基因添加 正常基因非特异插入基因组以补偿异常基因的功能缺陷 3 基因失活 抑制 关闭异常表达的基因 矫正突变 三 基因治疗的策略 4 重新开放已关闭的基因 四 基因治疗的方法 一 体细胞的基因治疗方法 2 受体细胞的选择 3 将治疗转移到受体细胞内 4 将带有目的基因的细胞重新输回体内体外基因治疗时 二 反义技术 antisensetechnology 三 RNA干扰 shortinterferenceRNA 1 治疗基因的制备 五 基因治疗的现状 1 一些单基因病的治疗严重复合免疫缺陷症 ADA综合症 血友病B 囊性纤维化 CF 苯丙酮尿症等2 Bata 地中海贫血病别醇嘌呤重新开放r基因3 多基因病心血管疾病 糖尿病 神经系统疾病等4 肿瘤5 其它疾病 HIV 六 基因治疗的问题 前景 问题 1 稳定性2 安全性3 导入基因的高效表达4 免疫性5 伦理问题前景 十分有潜力的技术 有深远的意义 基因治疗作为一项新的治疗技术 将不只限于遗传病和肿瘤的治疗 在可见的将来 它将是临床上多种疾病可选择的治疗方法 应用腺苷脱氨酶基因ADA 经逆转录病毒载体导入严重复合免疫缺陷症 SCID 遗传病的常规治疗 一 外科治疗矫正畸形 组织和器官移植 二 内科治疗用药物及饮食治疗1 禁其所忌酶缺乏不能对底物进行正常代谢的遗传病 2 去其所余酶缺乏使体内贮存过多的 毒物 所致的遗传病促排泄剂或螯合剂 换血或血浆过滤等3 补其不足由于基因缺陷使体内缺乏某种酶和蛋白质而导致功能丧失的遗传病 ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA ACGTCGGTGCGTCGCTTTGCAGCCACGCAGCGA ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA 突变基因原位修复 突变 修复 带异常基因的染色体DNA分子 带正常基因的外源同源片段 同源重组过程 添加正常基因 使 重新表达 形成HbF HbF代偿HbA的功能 目的基因的制备方法 1 从基因组中分离2 化学合成3 用mRNA逆转录合成cDNA4 从基因文库中筛选5 PCR合成 受体细胞的选择 选择受体细胞的原则 1 易于从人体分离又便于输回体内2 易于接受外源的遗传物质3 能够分裂 生命周期长4 患病的器官或部位 常用的受体细胞 骨髓干细胞皮肤纤纬细胞血管内皮细胞肝细胞淋巴细胞 治疗基因的转移方法 3 腺相关病毒 Adeno AssociatedVirus AAV 4 单疱疹病毒 Herpessimplexviruses HSV 化学法磷酸钙共沉淀 物理法微粒轰击 电穿孔法 显微注射脂质体法 生物法将病毒 virus 改造成缺陷病毒载体 1 逆转录病毒载体 Retroviruses 2 腺病毒介导的基因转移 Adenoviruses 脂质体法 优点 易大量制备无致病性细胞类型多治疗过程可控 缺点 转化效率不高血循中快速清除 肝巨噬细胞 逆转录病毒的改造 逆转录病毒感染细胞过程 逆转录介导基因转移的优缺点 优点 1 能高效率的感染宿主细胞 100 2 其宿主范围广泛 包括来自不同种的生物和细胞类型3 被整合的基因在宿主基因组中稳定表达4 用复制缺陷的重组逆转录病毒感染 毒性小缺点 1 只能感染分裂细胞2 其外源DNA的容量太小3 安全性问题 激活癌基因的潜在性 腺病毒感染细胞的过程 腺病毒介导基因转移的优缺点 优点 1 具有较广的宿主范围 能感染除造血细胞以外的几乎所有细胞2 可以感染分裂及非分裂细胞3 能高效地感染宿主细胞4 外源基因容量大5 安全性较高 不引起癌基因激活 缺点 1 技术上需进一步改进2 不整合到人类基因组腺病毒是基因治疗载体的发展方向 1 野生型的AAV为非病原性 其安全性高2 AAV病毒颗粒的物理化学性质较为稳定3 应用宿主范围较广 使用于分裂及非分裂细胞4 可整合入宿主染色体上 可长期表达目的蛋白 腺相关病毒载体 优点 缺点 重组AAV的制作较为繁杂 效率低 滴度低 单疱疹病毒载体 优点具有对神经元的特异的亲和力可插入的基因片段容量很大 可达40 50kb缺点对细胞有较大的毒性 反义技术 反义技术 antisensetechnology 也称反义寡核苷酸 是指利用人工合成的反义RNA或反义DNA来阻断基因的转录或翻译 控制细胞生长的中间阶段 使基因不能转录或翻译 因而不能合成蛋白质 以达到治疗某中疾病的目的 1 将cDNA导入基因组中 转录得反义RNA 2 直接输入反义寡核苷酸 二 反义基因技术 阻断转录 类型 1 反义RNA技术 阻断翻译 转录阻断 反基因技术示意图 正常细胞 无细胞毒性 胞嘧啶脱氨酶基因 erbB 2启动子 5 FC 5 FC 5 FU 细胞毒性 肿瘤细胞 肿瘤特异性高表达因子 药物靶向治疗肿瘤 细胞死亡 RNA干扰 RNAinterferenceRNAi 2003年10大科学进展 第四 Science 正常生物体内一些小的双链RNA可以抑制特定基因表达的一种现象 当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的小双链RNA doublestrandedRNA dsRNA 时 可以通过促使该mRNA降解来高效 特异的阻断体内特定基因的表达 从而导致基因表达沉默的现象 这种现象发生在转录后水平 又称为转录后基因沉默 post transcriptionalgenesilencing PTGS 这些小的双链RNA称为siRNA Small shortinterferingRNA siRNA RISC RNA inducedsilencingcomplexRNA诱导沉默复合物 RNAiingenetherapy 基因治疗的现状 1 基因治疗的现状 2 基因治疗的现状 3 基因治疗的现状 4 基因治疗的现状 5 基因治疗的现状 6 HemophiliaB FIXfunctionreduced X linked Malestobleedaftercircumcision 第一例临床实验 中国上海1995 1996年载体 AAV自体皮肤成纤维细胞两名血友病B患者 兄弟 先后治疗了四名患者FIX水平升高2倍并持续了1年以上2003年获得国家批准进行中国首次AAV基因治疗血友病B临床试验 中国的基因治疗