杯碟法检测方法090626-新

杯碟法检测青霉素酶的方法 试行 杯碟法检测青霉素酶的方法 试行 1 适用范围适用范围 本方法适用于原料奶 灭菌乳 乳饮料中青霉素酶的检测 2 实验原理实验原理 青霉素酶能够破坏青霉素对藤黄微球菌的抑制作用 而舒巴坦能特异性地抑制青 霉素酶的这种作用 在样品中先后加入适量的舒巴坦和青霉素 采用杯碟法通过测 定抑菌圈大小差异来检测样品中的青霉素酶 酶活单位 Active Unit 在室温 25 下 1min 分解 1 mol 的青霉素 G 所需的酶量为一个单位 即 1IU 3 试剂与材料试剂与材料 除另有规定外 所有试剂为分析纯 水为 GB T6682 2008 规定的三级水 3 1 菌种 藤黄微球菌 Micrococcus Luteus 菌种号 CMCC B 28001 3 2 青霉素酶标准品 纯度 90 酶活 1200IU mg 1000 万青霉素效价单位 4 保存 3 3 舒巴坦标准品 纯度 89 2 4 保存 3 4 青霉素 G 色谱级 纯度 97 分析纯需适当增加标准工作溶液浓度 密封避 光 防潮 4 保存 3 5 磷酸二氢钾 KH2PO4 纯度 99 5 3 6 磷酸氢二钾 K2HPO4 纯度 98 3 7 氯化钠 NaCL 纯度 99 5 3 8 磷酸盐缓冲溶液 pH6 0 取 8g 磷酸二氢钾 3 5 和 2g 磷酸氢二钾 3 6 用 1000ml 水溶解 121 高压灭菌 15min 3 9 生理盐水 称取 8 5g 氯化钠 3 7 溶解于 1000ml 水中 121 高压灭菌 15min 3 10 青霉素酶标准储备溶液 准确称取 精确至 0 001g 青霉素酶标准品 3 2 用生理盐水 3 9 溶解并稀释 配成酶活力为 1000IU ml 的标准储备溶液 4 保 存 可使用 1 个月 3 11 青霉素酶标准工作液 用生理盐水 3 9 将青霉素酶标准储备溶液 3 10 稀释配制成酶活力为 1IU ml 的标准工作溶液 需当天配制使用 3 12 舒巴坦标准储备溶液 准确称取 精确至 0 001g 舒巴坦标准品 3 3 用磷 酸盐缓冲液 3 8 溶解并定容为 10mg ml 4 保存 可使用 1 2 个月 3 13 舒巴坦标准工作溶液 用磷酸盐缓冲溶液 3 8 将舒巴坦标准储备溶液 3 12 稀释配制成浓度为 1mg ml 需当天配制使用 3 14 青霉素 G 标准储备溶液 准确称取 精确至 0 001g 青霉素 G 3 4 用磷酸 盐缓冲溶液 3 8 溶解并定容为 1mg ml 4 棕色瓶中保存 可使用 1 2 个月 3 15 青霉素 G 标准工作液 取青霉素 G 标准储备液 3 14 用磷酸盐缓冲液 3 8 稀释 配制成浓度为 10 g ml 4 保存 可使用 2 3 天 3 16 空白奶粉 脱脂奶粉 3 17 灭菌脱脂乳 使用脱脂奶粉 3 16 按 GB T4789 27 2008 中 4 2 执行 10g 奶粉 90ml 水 113 灭菌 20min 3 18 菌种培养基 LB 营养琼脂 3 19 抗生素 号培养基 4 4 仪器与设备仪器与设备 4 1 天平 精确到 0 001g 4 2 冰箱 4 4 3 恒温培养箱 36 1 4 4 恒温水浴锅 55 1 4 5 恒温干燥箱 4 6 高压灭菌锅 4 7 抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺 精确到 0 1mm 4 8 旋涡混匀器 4 9 移液枪 20 200 l 100 1000 l 1000 5000 l 4 10 培养皿 内径 90 0 5mm 皿底平整光滑 厚薄均匀无凹凸现象 4 11 牛津杯 不锈钢管 外径 7 8 0 1mm 内径 6 0 0 1mm 高度 10 0 0 1mm 4 12 陶瓦盖 内径 110mm 外径 116mm 高度 26mm 5 5 检测步骤检测步骤 5 15 1 试样制备试样制备 5 1 1 液体奶 取奶样 25g 混合均匀 待处理 5 1 2 酸奶 取酸乳样品 25g 经生理盐水 1 1 稀释 混合均匀 待处理 5 1 3 阴性对照样品 灭菌脱脂乳 5 1 4 阳性对照样品 移取青霉素酶标准工作液加入到灭菌脱脂乳中 混合均匀配 制成酶活力为 0 1IU ml 的阳性对照样品 4 保存 可使用 2 3 天 5 25 2 试样处理试样处理 5 2 1 取试样 900 l 分别放入 A B C D 四个 2ml 离心管中 加入以下配置 加 样顺序按试剂排列顺序 A 加 50 l 舒巴坦标准工作溶液 再加入 50 l 青霉素 G 标准工作溶液 B 加 50 l 舒巴坦标准工作溶液 再加入 50 l 磷酸盐缓冲液 C 加 100 l 磷酸盐缓冲液 D 加 50 l 青霉素 G 标准工作溶液 再加入 50 l 磷酸盐缓冲液 将上述混合液用涡旋混匀器充分振荡混匀 室温放置 1 小时后检测 同时做阴性对照和阳性对照样品各一组 5 35 3 菌悬液的制备及用量菌悬液的制备及用量 将菌种接种于菌种培养基斜面试管中 工作菌株正常使用传代数为 3 10 代 一 般可使用 1 2 个月 36 1 培养 22 24h 使用 4ml 生理盐水将经过培养的新鲜斜 面培养物洗下 混合均匀 得到菌悬液 含菌量大约 1 109CFU ml 将菌悬液以 2 的比例加入到 LB 营养琼脂中 菌悬液中含菌量的多少 以能使 0 5 g ml 的青霉素 G 工作液产生约 22mm 清晰 完整的抑菌圈为宜 5 45 4 检测用平板的制备检测用平板的制备 在无菌平皿中注入抗生素 号培养基 10 15ml 作为基础培养基 放置在水平台 面上 将皿盖倾斜在一侧 待其自然凝固后将皿盖盖好备用 将灭菌的菌种培养基溶化后在水浴锅中冷却至 55 左右 加入适量的菌悬液 5 3 混匀 移取 5ml 注入铺有基层培养基的培养皿中 迅速均匀的摊开 放置在 水平台面上凝固 在每个培养基表面均匀对称放置 4 个牛津杯后待用 加完培养基后一定要放置水平 制作过程中要防止污染 加抗生素 号培养基后 注意冷凝水的控制 检测用平板需当天使用当天制作 且保证是同一批次 5 55 5 试样测定试样测定 取 A B C D 四个离心管中的试液各 200 L 分别加入到检测平板的四个牛 津杯中 每组试验至少做三平行 将陶瓦盖盖好 培养皿水平放置于 36 1 培养 箱中培养 22h 24h 培养结束后去除陶瓦盖和牛津杯后待结果报告 5 65 6 结果判定结果判定 使用抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺分别精确测量 A B C D 各抑菌圈直 径 当 B 和 C 相等或者差异在 1mm 之内时 实验的重复性良好 可以继续报告结果 当 A 直径 D 直径 3mm 时 判定样品中的青霉素酶结果为阴性 A 直径 D 直径 3mm 时 判定样品中的青霉素酶结果为阳性 如果阴性对照和阳性对照的结果均符合上述条件 但样品测定的培养皿中所有 牛津杯均未出现抑菌圈 尤其是 A 圈和 D 圈 应使用生理盐水将样品做适当稀释后 再进行测定 直到培养皿中出现大于 10mm 清晰 完整的抑菌圈为止 6 6 注意事项注意事项 6 1 药品配制 6 1 1 在配制储备液和工作液时 一定要正确识别所购药品的纯度和其所标识的单 位 然后根据所配储备液和工作液要求的浓度和单位 进行准确配制 6 1 2 用于配制药品的容器如不能高压灭菌 需用 75 酒精进行 2 3 次的消毒 再用 所使用的无菌溶剂 生理盐水 磷酸盐缓冲溶液 进行 2 3 次的润洗后再进行药品 的配制 6 1 3 配制好的工作液最好存放于无菌容器中 4 下避光保存 临用前 将所使用 工作液部分的转移到无菌容器 离心管 试管等 中使用 防止吸样过程中对试剂 造成污染 6 1 4 每次在新旧试剂更换前 均需先做对照试验 在对照试验符合要求后再更换 6 2 菌悬液制作 6 2 1 藤黄微球菌复苏和传代注意事项 见附录 1 6 2 2 用于洗培养斜面上菌种的生理盐水的温度至少要达到室温状态 6 2 3 倒入的 LB 营养琼脂的温度要求控制在 40 50 之间 防止因温度太低导致平 板制作不够水平 温度太高将菌种灭活或变异 6 2 4 将已经加入菌悬液的 LB 培养基混匀后 迅速的转移到加有抗生素 号培养基 的平皿中 不要在水浴锅中长时间放置 导致菌种的失活或变异 6 2 5 根据所传代菌种量的多少和使用时间 可适当增加或减少生理盐水的量 保 证平板中的菌量和青霉素的量达到最佳配比 使检测后的抑菌圈控制在 17 27mm 之 间 6 3 检测平板的制作 6 3 1 加完培养基后的平板要求水平放置 制作过程中要防止污染 加抗生素 号 培养基后注意冷凝水的控制 6 3 2 放入牛津杯前 要先识别所用平板是否水平 是否会对试验有影响 6 3 3 检测用平板要求当天使用当天制作 且保证是同一批次 6 4 试样处理和测定 6 4 1 所检测样品在使用前要求充分混匀 避免检测结果偏差太大 6 4 2 每次试验必须做阴阳性对照 6 4 3 如果所检测样品的粘稠度或浓度太大 可根据产品性质做适当的稀释后再进 行检测 6 4 4 在试样处理和检测过程中 要求加样量和加药量必须准确 保证检测结果的 可参考性 6 4 5 在每个 900ul 的样品 A B C D 中加入药品时 必须按照方法中的顺序 逐个加入 如舒巴坦和青霉素不可以颠倒加入 6 4 6 放置牛津杯时 必须均匀对称的放置 以免各自产生的抑菌圈有交叉或贴壁 现象 6 4 7 将处理好的样品加入牛津杯时 注意枪头与牛津杯不要碰撞 使加入的样品 从杯底渗流 影响最终结果判定 6 4 8 在培养过程中 要保持平皿水平 放置因牛津杯位置不够水平 影响最终结 果判定 6 5 结果报告 6 5 1 在进行结果报告前 一定要识别试验现象是否正常 如阴阳性对照试验是否 符合要求 抑菌圈的大小是否符合试验规定 抑菌圈是否是圆的 是否有交叉 平 皿是否有污染等 6 5 2 如果 B C 抑菌圈超出实验重复性范围 则结果不能报告 6 5 3 如果试验中 A B C D 都未出现抑菌圈 则需将样品做适当稀释后再检测 如果试样中 A B C D 都出现抑菌圈 且抑菌圈的大小基本一致 是样品自身含有 抑菌物质 质管部中心化验室 2009 年 6 月 29 日 附录附录 1 藤黄微球菌复苏和传代注意事项 藤黄微球菌复苏和传代注意事项 因藤黄微球菌容易变异且培养时间长 所以在进行复苏或传代时 必须严格执 行无菌操作 防止对菌种的污染和变异 具体操作流程图如下 备注 3 10 代的传代方式依次类推 肉汤和斜面复苏根据菌种生长情况可自行选择 具体操作说明 1 藤黄微球菌在进行复苏时 首先在固体菌种中加入 30 40 的肉汤 0 3 0 8ml 然后采用液体培养和固体斜面培养两种方式进行菌种的复苏 其中液体培养是将溶 解好的菌种少量加入到 5ml 肉汤中进行培养 固体斜面培养是用接种环挑取适量的 溶解好的菌种进行斜面划线 2 接种用斜面的制作 最好选用 18 180mm 的试管 LB 培养基斜面制作见下图 即从试管底到距试管底部大约 15mm 左右的距离充满培养基 从 15mm 左右开始制 作大约 40 50mm 的斜面 斜面不要求太长 否则在接种过程中与接种环容易交叉 导致菌种的污染和变异 加入 0 3 0 8ml 的肉汤 30 40 充分溶解 22 24 小时培养22 24 小时培养 22 24 小时培养22 24 小时培养 藤黄微球菌 5ml 肉汤培养基LB 斜面划线 LB 斜面划线LB 斜面划线 菌种的复苏 第一代菌种 LB 斜面划线LB 斜面划线 第二代菌种 3 接种过程中接种环每次灼烧后必须待整个接种环 包括灼烧过的 杆 的部分 均彻底冷却后 方可进行后续