分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用完整版本.ppt

分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用 中南大学病理学系湘雅医院病理科 周建华 肿瘤靶向治疗 Targettherapyofcancer 依据已知肿瘤发生的异常分子和基因 设计和研发针对这些特定的分子和靶点药物 选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法 靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶基因变异类存在与否和变异类型 个体化治疗的雏形 荧光原位杂交 Fluorescenceinsituhybridization FISH 技术 简介 FISH FluorescenceInSituHybridization利用荧光标记的DNA探针检测组织或细胞内与其互补的DNA片段应用 遗传病诊断血液肿瘤实体瘤样本 羊水 绒毛 流产组织 外周血 骨髓 体液及各种肿瘤组织等 FISH检测染色体易位 Translocation 在淋巴瘤分型中的应用 FISH技术在淋巴造血系统肿瘤中的应用 检测技术特点 不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同优点适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本 适用于细胞数量少 形态不典型的活检及穿刺组织 必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后诊断 FISH基因检测在淋巴瘤的应用 弥漫大B细胞淋巴瘤 DLBCL 按免疫组化亚型分为CD5阳性DLBCL生发中心B细胞样变型 GCB 非生发中心B细胞样变型 non GCB 3类 可根据CD10 BCL6 MUM1的表达区分生发中心B细胞样变型 非生发中心B细胞样变型 30 瘤细胞表达CD10或CD10 BCL 6 MUM 1 诊断为GCB 其他病例则为non GCB BCL6基因断裂 辅助诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤 BCL6基因断裂重排 判断预后 目前研究确定至少40 的DLBCL涉及BCL6基因重排 一项针对102名DLBCL患者的BCL6重排情况及其与预后关系的研究显示 BCL6阳性患者诊断治疗36个月后 疾病停止发展的比率为82 携带有BCL6重排的病例预后较好 BCL6基因断裂与弥漫性大B细胞淋巴瘤 Offit K NEnglJMed 1994 331 2 p 74 80 结果判读 IGH CCND1融合基因可见于95 的套细胞淋巴瘤 是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤鉴别的重要指标 IGH CCND1融合基因 辅助诊断套细胞淋巴瘤 IGH CCND1融合基因与套细胞淋巴瘤 l正常细胞 两个红色信号 两个绿色信号 l异常细胞 一个红色信号 一个绿色信号 两个融合信号 API2 MALT1基因检测试剂盒 探针 GLPAPI2 GLPMALT1 凋亡抑制因子2基因 apoptosisinhibitor 2 API2 位于11号染色体 粘膜相关淋巴组织基因 Mucosa associatedlymphoidtissue1 MALT1 位于18号染色体 API2基因与MALT1基因的融合导致凋亡抑制的增加 引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势 API2 MALT1融合基因的检测可以指导抗HP治疗 胃MALT淋巴瘤与幽门螺旋杆菌 HP 感染导致的慢性胃炎有关 MALT1 API2融合基因阴性的患者抗HP治疗有效 阳性患者抗HP治疗无效 API2 MALT1融合基因检测意义 l正常细胞 两个红色信号 两个绿色信号 l异常细胞 一个红色信号 一个绿色信号 两个融合信号 BCL2 IGH重排发生在约80 85 的FL患者中 检测BCL2 IGH基因重排可以辅助诊断FL BCL2 IGH阴性的FL患者3年生存率为100 而阳性者只有54 阴性者3年疾病无进展为87 5 而阳性者只有13 BCL2 IGH融合基因与滤泡性淋巴瘤 BCL2 IGH融合基因 辅助诊断滤泡性淋巴瘤 BCL2 IGH融合基因 判断预后 l正常细胞 两个红色信号 两个绿色信号 l异常细胞 一个红色信号 一个绿色信号 两个融合信号 结果判读 阳性结果 结果判读 阳性结果 约80 的伯基特淋巴瘤病例发生t 8 14 q24 q32 约15 的伯基特淋巴瘤病例发生t 2 8 p11 q24 约5 发生t 8 22 q24 q11 染色体易位导致C MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志 可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断 C MYC基因断裂与伯基特淋巴瘤 辅助诊断伯基特淋巴瘤 结果判读 阳性结果 FISH技术在乳腺癌靶向治疗应用 乳腺癌Her 2基因 致癌基因 Her 2基因 位点 17q11 2 q12 编码蛋白 跨膜蛋白 与表皮生长因子受体部分同源 25 30 乳腺癌病人都有HER 2的扩增 HER 2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标 HER2扩增的乳腺癌更具有侵袭性生长能力 乳腺癌Her 2基因及蛋白检测 Cerb B 2 3 完全强膜阳性细胞 30 2 1 FISH检测是否有基因扩增 基因突变检测方法 1 RNA酶A切割 RnaseAcleavage 2 变性梯度凝胶电泳 DGGE 3 杂合双链分析法 HA 4 化学切割错配 CCM 5 碳化二亚胺检测 Carbodiimide CDI 6 酶促切割错配 EnzymeMismatchCleavage EMC 7 单链构象多态性 Single StrandConformation 8 切割片段长度多态性9 DNA测序 Sequencing 10 双脱氧指纹图谱法 DideoxyFinger printing ddF 11 错配接合蛋白检测12 蛋白截短测试 proteintruncationtest 方法 13 变性的高效液相色谱检测 DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC 14 DNA芯片技术 DNAchip 15 等位基因特异性扩增16 等位基因特异性寡核苷酸片段分析 Allele SpecificOligonucleotide ASO 17 引物延伸检测 PrimerExtension PEX 18 寡核苷酸连接检测 OligonucleotideLigationAssay OLA 19 限制性片段分析 RestrictionFragmentAnalysis 20 突变体富集PCR法 mutant enrichedPCR 21 蝎形探针扩增阻滞突变系统 Scorpionsamplificationrefractorymutationsystem 肺癌组织EGFR基因扩增和突变检测及其临床意义 研究背景 研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗效果非常显著 存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼的治疗敏感 存在EGFR基因扩增的肺癌 肠癌病人对分子靶点药物更为敏感 检测大肠癌有无EGFR过度表达 只要 1 的癌细胞的胞膜强阳性染色即判断为3 可作为应用西妥昔单抗的指征 FISH检测EGFR基因扩增标本类型 石蜡包埋组织 手术 活检 穿刺 冰冻组织胸 腹水沉渣细胞探针类型 GLPEGFR CSP7定量PCR检测EGFR基因突变分型突变类型 19exon 2235 2249位点 15bp缺失突变19exon 2240 2257位点 18bp缺失突变19exon 2240 2251位点 12bp缺失突变21exon2573位点T G碱基置换突变21exon2582位点T G碱基置换突变 EGFR基因变异检测 FQ PCR分型技术检测EGFR突变 存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图 71例肺癌组织中检测出6例突变样本 FQ PCR检测15bp缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线 按荧光信号值的高低依次为9号 12号 13号 55号 38号和33号标本 15bp缺失突变型DNA的测序图 sense antisense 目前K RAS突变检测常用技术 方法 直接测序焦磷酸测序高分辨率熔解曲线PCR RFLP芯片杂交Real TimePCR 肿瘤组织的确认和筛选 显微切割肿瘤提取DNA 相应的PCR反应或杂交 相关的分析和检测 K ras突变检测基本流程图 直接测序 DirectSequencing PCR扩增后产物直接测序双脱氧核苷酸链终止法 Sanger法 DNA片段是荧光标记的 这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离 荧光分子被激发而发光 发出的光信号被检测系统检测 K ras突变检测结果 疗效预测标志物与预后判断标志物 疗效预测标志物 能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗预后判断标志物 在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标记物18号染色体长臂 18q 缺失某些分子标志物兼具两种作用胸腺嘧啶合成酶 Thymidylatesynthase EGFR作为预后因子的价值 EGFRexpressioncorrelateswithpoorprognosis DFS Disease freesurvival OS overallsurvival Cetuxamab 西妥昔单抗 人源化嵌合单抗 IgG1 靶向作用于表皮生长因子受体 EGFR 阻断EGF和TGF 与EGFR的结合 抑制酪氨酸激酶活性和其后的肿瘤生长200 年获得FDA审批资格治疗结直肠癌Panitumumab 帕尼单抗 完全人源化单克隆抗体 IgG2 靶向作用于表皮生长因子受体 EGFR 2005年7月获得FDA快速通道审批资格治疗结直肠癌 结直肠癌分子靶向治疗药物 KRAS突变 KRAS突变可不依赖EGFR受体途径 自行激活RAS MAPK通路导致ERBITUX耐药KRAS突变与Erbitux疗效及患者生存相关KRAS突变并非孤立事件KRAS突变常伴随BRAF突变 并与CpG岛甲基化表型 CIMP 1 2相关KRAS突变常伴随PI3K突变3 Li vreA etal JClinOncol2008 26 374 379 MAPK mitogen activatedproteinkinase K ras基因野生型患者能从这类药物治疗中获益 K ras基因突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益 反而徒增不良反应危险和治疗费用 抗EGFR治疗和K ras突变相互排斥 K ras基因抗EGFR治疗关系密切 2009年7月FDA批准了对西妥昔单抗和帕尼单抗说明书标签的修改 结直肠癌分子靶向治疗药物 注明KRAS基因突变的结直肠癌患者不推荐这使用这两种用药物 K ras基因突变 20 60 结直肠癌K ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期 原发灶和转移灶的K ras基因高度保持一致 K ras基因突变 NCCN临床实践指南指南明确指出所有转移性结直肠癌患者都应检测K ras基因状态 美国美国临床肿瘤学会 ASCO 推荐把K ras基因突变检测作为结直肠癌患者接受EGFR单抗治疗的预测指标 欧盟药品审评管理局规定 cetuximab及panitumumab用于mCRC的治疗前 患者必须确定为K ras野生型 K ras与结直肠癌治疗 结直肠癌 CRC 缺乏EGFR基因突变 对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌 mCRC 临床试验中110例活检标本进行的研究未发现EGFR基因突变 外显子18 21 Khambata FordS etal JClinOncol2007 25 3230 3237 抗EGFR治疗前检测KRAS基因突变的理由 避免不必要的不良反应控制不必要的费用确认能够从治疗中获益的野生型患者避免治疗对突变型患者的潜在毒性 CHMPgaveapositiveopinionforERBITUXMay29 2008 butforpatientswithwild typeKRAStumors 810名胃癌病人有HER2基因的扩增 约占参与实验总人数的22 晚期胃癌接受标准化疗联合Herceptin治疗的患者 平均生存期由11 1个月延长到13 8个月 高倍扩增者