浙江大学生物化学实验甲 2011-酵母蔗糖酶的提取原理

1 酵母蔗糖酶的制备原理酵母蔗糖酶的制备原理 一 蔗糖酶一 蔗糖酶 invertase or sucrase 简介简介 蔗糖酶 蔗糖酶 EC 3 2 1 26 为水解酶类 主要存在于酵母中 如啤酒酵母 面 为水解酶类 主要存在于酵母中 如啤酒酵母 面 包包 酵母 也存在于曲霉 青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中 可专一性地催化蔗酵母 也存在于曲霉 青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中 可专一性地催化蔗 糖水解为果糖和葡萄糖的反应 糖水解为果糖和葡萄糖的反应 酵母蔗糖酶的分子量约酵母蔗糖酶的分子量约 270000D 因来源不同 分子量有差异 因来源不同 分子量有差异 pI 约约 5 6 最适 最适 pH4 6 耐酸和热 最适温度 耐酸和热 最适温度 50 耐乙醇 因此可用乙醇沉淀进行 耐乙醇 因此可用乙醇沉淀进行 分离纯化 分离纯化 二 酵母蔗糖酶的分离纯化二 酵母蔗糖酶的分离纯化 本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步 缓冲液抽提 加热纯化 乙醇分级沉本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步 缓冲液抽提 加热纯化 乙醇分级沉 淀 淀 DEAE SepharoseDEAE Sepharose 柱层析分离纯化 柱层析分离纯化 1 前三步分离纯化的原理如下 前三步分离纯化的原理如下 离子交换 离子交换 DEAE SepharoseDEAE Sepharose 柱层析分离纯化的原理柱层析分离纯化的原理 1 1 离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换柱层析分离混合物的基本原理 离子交换层析 离子交换层析 IonIon ExchangeExchange ChromatographyChromatography 是一种根据待分离物质的 是一种根据待分离物质的 阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合 即根据物质酸碱性 极性等阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合 即根据物质酸碱性 极性等 差异 通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术 差异 通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术 离子交换层析是一种液离子交换层析是一种液 固相层析技术 其中 液相称洗脱液 固相的惰性固相层析技术 其中 液相称洗脱液 固相的惰性 离心离心 上层 脂溶性物质上层 脂溶性物质 酵母细胞酵母细胞破细胞破细胞中层 水层 蔗糖酶 可溶性杂质中层 水层 蔗糖酶 可溶性杂质 等等 缓冲液缓冲液 石英砂石英砂 研磨研磨 下层 沉淀 细胞碎片 变性蛋白下层 沉淀 细胞碎片 变性蛋白 等等 保温保温 30 分钟分钟 取中层取中层 水层 水层 使热不稳定蛋白变性使热不稳定蛋白变性 50 水浴中水浴中 离心离心上清 蔗糖酶 可溶性杂质等上清 蔗糖酶 可溶性杂质等 沉淀 变性蛋白沉淀 变性蛋白 离心离心 取上清取上清使蔗糖酶沉淀使蔗糖酶沉淀 加等体积加等体积 95 乙醇乙醇 上清 杂蛋白及可溶性杂质等上清 杂蛋白及可溶性杂质等 冰浴中冰浴中 20 分钟分钟 沉淀 蔗糖酶 杂蛋白等沉淀 蔗糖酶 杂蛋白等 2 支持介质称离子交换剂 在离子交换剂上具有带电基团 不同的交换剂所具有支持介质称离子交换剂 在离子交换剂上具有带电基团 不同的交换剂所具有 的带电基团的电荷性质不同 如交换剂上的带电基团带正电荷 则可结合溶液的带电基团的电荷性质不同 如交换剂上的带电基团带正电荷 则可结合溶液 液相 中的阴离子 这样的交换剂称为阴离子交换剂 如 液相 中的阴离子 这样的交换剂称为阴离子交换剂 如 DEAEDEAE 纤维素 纤维素 二乙二乙 胺基乙基胺基乙基 纤维素纤维素 强碱型的离子交换树脂等 反之 如交换剂上的带电基团 强碱型的离子交换树脂等 反之 如交换剂上的带电基团 带负电荷 则可结合溶液中的阳离子 这样的交换剂称为阳离子交换剂 如带负电荷 则可结合溶液中的阳离子 这样的交换剂称为阳离子交换剂 如 CM CM 纤维素 强酸性的离子交换树脂等 离子与交换剂的静电结合作用具有如下纤维素 强酸性的离子交换树脂等 离子与交换剂的静电结合作用具有如下 特点 特点 可逆性 在一定条件下 结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开可逆性 在一定条件下 结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开 交换剂并随洗脱液流出层析柱 交换剂并随洗脱液流出层析柱 选择性 离子所带的电荷越多 水合离子半径选择性 离子所带的电荷越多 水合离子半径 越小越易结合 越小越易结合 遵循质量作用定理 对某一特定离子 随遵循质量作用定理 对某一特定离子 随 离子浓度的增大 则遵循质量作用定理向与交离子浓度的增大 则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行 换剂结合方向进行 由于离子与交换剂的结合具有上述特点 因此如混合物中的各组分具有不由于离子与交换剂的结合具有上述特点 因此如混合物中的各组分具有不 同的电荷性质 或虽然电荷性质相同 但电荷数不同 则各组分与离子交换剂同的电荷性质 或虽然电荷性质相同 但电荷数不同 则各组分与离子交换剂 的静电结合能力就不同 与交换剂上带电基团电荷性质相反 带电荷数目越多的静电结合能力就不同 与交换剂上带电基团电荷性质相反 带电荷数目越多 的离子越容易吸附在交换剂上 带电数目越少 结合能力越弱 如离子所带的的离子越容易吸附在交换剂上 带电数目越少 结合能力越弱 如离子所带的 电荷与交换剂上带电基团的电荷性质相同 则完全不能结合于交换剂上 经洗电荷与交换剂上带电基团的电荷性质相同 则完全不能结合于交换剂上 经洗 脱液洗脱后 各组分即按离子结合能力由小到大的顺序依次洗脱出来 从而达脱液洗脱后 各组分即按离子结合能力由小到大的顺序依次洗脱出来 从而达 到分离混合物的目的 到分离混合物的目的 当用离子交换层析分离生物大分子如蛋白质 核酸时 由于生物大分子当用离子交换层析分离生物大分子如蛋白质 核酸时 由于生物大分子 蛋白质 常为两性电解质 在不同的 蛋白质 常为两性电解质 在不同的 pHpH 条件下 组成蛋白质的条件下 组成蛋白质的 AAAA 解离情况解离情况 不同 导致蛋白质具有不同的电荷性质和电荷数目 因此可通过调节溶液的不同 导致蛋白质具有不同的电荷性质和电荷数目 因此可通过调节溶液的 pHpH 使待分离的蛋白质混合物选择性地吸附于离子交换剂上 再通过改变洗脱 使待分离的蛋白质混合物选择性地吸附于离子交换剂上 再通过改变洗脱 液的离子强度和液的离子强度和 pHpH 控制这种结合能力 从而使蛋白质混合物按结合能力由小 控制这种结合能力 从而使蛋白质混合物按结合能力由小 到大的顺序依次从层析柱中洗脱下来 到大的顺序依次从层析柱中洗脱下来 本试验用本试验用 pH7 3pH7 3 0 020 02 mol Lmol L 的的 Tris HClTris HCl 缓冲液进行缓冲液进行 0 0 0 5mol L0 5mol L NaClNaCl 的的 溶液中离子溶液中离子 阴离子交换剂阴离子交换剂 3 线性梯度洗脱 在该条件下 高于酶的等电点 线性梯度洗脱 在该条件下 高于酶的等电点 酵母蔗糖酶带负电荷 因此当 酵母蔗糖酶带负电荷 因此当 用阴离子交换剂 用阴离子交换剂 DEAE SepharoseDEAE Sepharose 进行分离时 酵母蔗糖酶结合于离子交换 进行分离时 酵母蔗糖酶结合于离子交换 剂上 通过改变洗脱液中盐浓度的方法即可将酵母蔗糖酶洗脱下来 剂上 通过改变洗脱液中盐浓度的方法即可将酵母蔗糖酶洗脱下来 2 2 离子交换离子交换 DEAE SepharoseDEAE Sepharose 柱层析的流程柱层析的流程 离子交换剂的准备 离子交换剂的准备 即将离子交换剂变成适于分离各类离子的形式 主要包括以下几步处即将离子交换剂变成适于分离各类离子的形式 主要包括以下几步处 理 理 a a 除去交换剂中的杂质和使交换剂溶胀 除去交换剂中的杂质和使交换剂溶胀 通常用通常用 0 5N0 5N 的的 HClHCl 和和 0 5N0 5N 的的 NaOHNaOH 处理 对阳离子交换剂先用处理 对阳离子交换剂先用 NaOHNaOH 洗 然后用洗 然后用 HClHCl 洗 对阴离子交换剂则相反 处理时间每次均为洗 对阴离子交换剂则相反 处理时间每次均为 30min30min 每次 每次 洗涤后 均要用大量水洗至中性 通过此步 一方面可除去牢固吸附在交换剂洗涤后 均要用大量水洗至中性 通过此步 一方面可除去牢固吸附在交换剂 上的杂质 另一方面可使交换剂充分膨胀 从而使交换剂的带电基团更多地暴上的杂质 另一方面可使交换剂充分膨胀 从而使交换剂的带电基团更多地暴 露在溶液中 露在溶液中 b b 除去交换剂中的细粒 否则影响流速 除去交换剂中的细粒 否则影响流速 c c 转型 即用适当的平衡离子平衡 从而使交换剂带上所希望的离子 但 转型 即用适当的平衡离子平衡 从而使交换剂带上所希望的离子 但 在实际应用中 此步常用起始缓冲液平衡 在实际应用中 此步常用起始缓冲液平衡 洗脱缓冲液的选择 洗脱缓冲液的选择 a a 缓冲溶液 缓冲溶液 pHpH 的选择 的选择 决定于被分离物质的等电点 稳定性和溶解度及交换剂上交换基团的解离决定于被分离物质的等电点 稳定性和溶解度及交换剂上交换基团的解离 常常 数 数 pKpK 值 值 若分离的目的物属酸性物质 用阴离子交换剂时 缓冲液要用高 若分离的目的物属酸性物质 用阴离子交换剂时 缓冲液要用高 于该物质等点电的于该物质等点电的 pHpH 值 并且此值 并且此 pHpH 值应低于该交换剂的值应低于该交换剂的 pKpK 值 反之若目的物值 反之若目的物 属碱性物质 用阴离子交换剂时 则缓冲液应选用低于该物质等电点的属碱性物质 用阴离子交换剂时 则缓冲液应选用低于该物质等电点的 pHpH 值 值 并且此并且此 pHpH 值应高于该交换剂的值应高于该交换剂的 pKpK 值 值 b b 缓冲液的离子种类及离子强度 缓冲液的离子种类及离子强度 为降低盐离子的竞争 起始缓冲液的浓度应尽可能低 为降低盐离子的竞争 起始缓冲液的浓度应尽可能低 0 0010 001 0 01M0 01M 当 当 确认该物质能被吸附后 可适当提高离子强度 以提高缓冲能力 确认该物质能被吸附后 可适当提高离子强度 以提高缓冲能力 缓冲液的离子应不影响被分离物质或干扰其活力的测定 也不应影响被测缓冲液的离子应不影响被分离物质或干扰其活力的测定 也不应影响被测 物质的溶解度或与一些必要的保护剂 物质的溶解度或与一些必要的保护剂 CaCa2 2 MgMg2 2 等 发生沉淀 洗脱液的梯度 等 发生沉淀 洗脱液的梯度 4 应可单纯增加缓冲液的离子浓度 但并不影响缓冲液的应可单纯增加缓冲液的离子浓度 但并不影响缓冲液的 pHpH 层析柱的选择 层析柱的选择 柱床体积至少要比束缚所有样品所需要的大柱床体积至少要比束缚所有样品所需要的大 2 2 5 5 倍 柱的形状一般以直径倍 柱的形状一般以直径 与高度之比为与高度之比为 1 1 1515 为好 为好 a a 当采用阶段洗脱时 不能用过长的柱 否则区带扩散较宽 降低分辨率 当采用阶段洗脱时 不能用过长的柱 否则区带扩散较宽 降低分辨率 即应用直径与高度之比较高的柱 此时 如必须增加离子交换剂的体积 则应即应用直径与高度之比较高的柱 此时 如必须增加离子交换剂的体积 则应 增加柱的直径 增加柱的直径 b b 当采用连续梯度洗脱时 则增加柱长能增加分辨率 但此时流速不能过 当采用连续梯度洗脱时 则增加柱长能增加分辨率 但此时流速不能过 快 快 装柱 装柱 柱装的好坏对层析效果影响很大 对装柱的要求是 交换剂在柱中分布要柱装的好坏对层析效果影响很大 对装柱的要求是 交换剂在柱中分布要 均匀 严防有节和气泡产生 沉积表面要平 均匀 严防有节和气泡产生 沉积表面要平 柱的平衡 柱的平衡 即用起始缓冲液充分洗涤柱床 已达到所需的即用起始缓冲液充分洗涤柱床 已达到所需的 pHpH 及离子强度 以免在层析及离子强度 以免在层析 中发生中发生 pHpH 的变化 当达到充分平衡时 流出液和起始缓冲液的的变化 当达到充分平衡时 流出液和起始缓冲液的 pHpH 和电导度均和电导度均 应相同 应相同 此步的另一目的还在于使柱床体积稳定下来即柱高不变和保持洗脱液流速此步的另一目的还在于使柱床体积稳定下来即柱高不变和保持洗脱液流速 的恒定 洗脱液流速的恒定可通过调节操作压或调节流出口内径的大小来控制 的恒定 洗脱液流速的恒定可通过调节操作压或调节流出口内径的大小来控制 增大操作压或加大流出口内径 流速均加快 洗脱液合适流速的确定应根据实增大操作压或加大流出口内径 流速均加快 洗脱液合适流速的确定应根据实 际情况而定 如果流速太快 则分辨率降低 每种物质的洗脱峰都要被其它物际情况而定 如果流速太快 则分辨率降低 每种物质的洗脱峰都要被其它物 质所污染 如果流速太慢 则洗脱峰会扩散 质所污染 如果流速太慢 则洗脱峰会扩散 上柱样品的准备与量的大小 上柱样品的准备与量的大小 样品应与起始缓冲液具有相同的样品应与起始缓冲液具有相同的 pHpH 和离子强度 上柱前样品应离心除去不和离子强度 上柱前样品应离心除去不 溶物 否则容易将柱堵住 上样量的大小取决于试验目的 样品中所要物质的溶物 否则容易将柱堵住 上样量的大小取决于试验目的 样品中所要物质的 浓度以及它对交换剂的亲和力 当所要物质在样品中含量很低 但对交换剂亲浓度以及它对交换剂的亲和力 当所要物质在样品中含量很低 但对交换剂亲 和力很大时 可以将几倍于柱床体积的样品通过柱 直到该成分饱和为止 然和力很大时 可以将几倍于柱床体积的样品通过柱 直到该成分饱和为止 然 后再进行洗脱 当要求高分辨率时 加样时紧密吸附的区带不应超过柱床体积后再进行洗脱 当要求高分辨率时 加样时紧密吸附的区带不应超过柱床体积 的的 10 10 阶段梯度洗脱时 加样量可相应大一些 因为此时解吸和再吸附的过 阶段梯度洗脱时 加样量可相应大一些 因为此时解吸和再吸附的过 5 程是不重要的 但紧密吸附的区带也不应超过柱床体积的一半 程是不重要的 但紧密吸附的区带也不应超过柱床体积的一半 加样时注意不要把床表面破坏 否则层析区带会不整齐 如有破坏 可搅加样时注意不要把床表面破坏 否则层析区带会不整齐 如有破坏 可搅 起数毫米交换剂 使其自然沉降平正为止 起数毫米交换剂 使其自然沉降平正为止 洗脱梯度的形状和吸脱液量的大小 洗脱梯度的形状和吸脱液量的大小 吸脱液体积 相对于柱床体积而言 的大小和吸脱梯度的形状 盐浓度的吸脱液体积 相对于柱床体积而言 的大小和吸脱梯度的形状 盐浓度的 变化能力 对柱的分辨率影响极大 洗脱可以用恒定组成的起始缓冲液来完成变化能力 对柱的分辨率影响极大 洗脱可以用恒定组成的起始缓冲液来完成 简单洗脱 简单洗脱 也可以用改变 也可以用改变 pHpH 或盐浓度 或二者均改变的洗脱液来完成 或盐浓度 或二者均改变的洗脱液来完成 pHpH 和盐浓度的改变又分为连续改变 梯度洗脱 和不连续改变 阶段洗脱 和盐浓度的改变又分为连续改变 梯度洗脱 和不连续改变 阶段洗脱 由于 由于 pHpH 的改变对生物大分子活性的影响很大 因此实际应用中常采用改变盐浓度来的改变对生物大分子活性的影响很大 因此实际应用中常采用改变盐浓度来 进行洗脱 进行洗脱 阶段洗脱在大量制备时用得较多 这种洗脱方式只有在对所要分离的离子阶段洗脱在大量制备时用得较多 这种洗脱方式只有在对所要分离的离子 在给定的离子交换剂上的行为了解得很清楚的情况下才能使用 在给定的离子交换剂上的行为了解得很清楚的情况下才能使用 由于采用梯度洗脱可大大提高分辨率 因此实际分离中 常采用连续梯度由于采用梯度洗脱可大大提高分辨率 因此实际分离中 常采用连续梯度 洗脱 一般常用约洗脱 一般常用约 5 5 倍柱床体积的洗脱液进行线性梯度洗脱 增加洗脱液的总倍柱床体积的洗脱液进行线性梯度洗脱 增加洗脱液的总 体积 即降低梯度的斜率 体积 即降低梯度的斜率 可使分辨率提高 但同时会使洗脱区带加宽 使洗 可使分辨率提高 但同时会使洗脱区带加宽 使洗 脱下来的样品浓度较稀 如减少洗脱液的总体积 则可增加梯度的斜率 使洗脱下来的样品浓度较稀 如减少洗脱液的总体积 则可增加梯度的斜率 使洗 脱峰显著变尖 洗下来的样品浓度较高 但分辨率相对变低 脱峰显著变尖 洗下来的样品浓度较高 但分辨率相对变低 柱的洗脱与收集 柱的洗脱与收集 选定了合适的洗脱液即梯度形状后 柱洗脱的主要问题就是流速了 洗脱选定了合适的洗脱液即梯度形状后 柱洗脱的主要问题就是流速了 洗脱 速速 度与所用交换剂的种类关系极大 选择柱的流速要注意两件事 度与所用交换剂的种类关系极大 选择柱的流速要注意两件事 a a 离子吸附到离子交换剂上的速度应比它们从交换剂上脱附的速度慢得多 离子吸附到离子交换剂上的速度应比它们从交换剂上脱附的速度慢得多 因此 加样时 样品上到离子交换剂上的速度应比洗脱它们所用的速度慢的多 因此 加样时 样品上到离子交换剂上的速度应比洗脱它们所用的速度慢的多 b b 流速与实际测定的最适流速偏离越大 则柱的分辨率降低得越多 流速 流速与实际测定的最适流速偏离越大 则柱的分辨率降低得越多 流速 太快 分辨率降低 流速太慢 则洗脱峰扩散 太快 分辨率降低 流速太慢 则洗脱峰扩散 c c 洗脱下来的样品常用部分收集器收集在试管中 一般每管收集 洗脱下来的样品常用部分收集器收集在试管中 一般每管收集 3 3 10ml10ml 降低每管收集的量 不能增加柱的分辨率 但却能充分表达出整个柱 降低每管收集的量 不能增加柱的分辨率 但却能充分表达出整个柱 6 的分辨率 测定每管的蛋白浓度和酶活力 或其它活力 的分辨率 测定每管的蛋白浓度和酶活力 或其它活力 确定各峰的位置 根 确定各峰的位置 根 据测得的数据作层析图谱 据测得的数据作层析图谱 交换剂的回