浙江大学生物化学实验甲 li-2009-秋冬-酵母蔗糖酶的纯化和性质分析总结

离子交换分离酵母蔗糖酶离子交换分离酵母蔗糖酶 一 蔗糖酶的纯化一 蔗糖酶的纯化 1 酵母细胞破碎 酵母细胞破碎 称取干酵母粉 15g 石英砂约 5g 放入研钵中直接研磨约 5 分钟 取 50 ml pH7 3 20mmol L 的 Tris HCl 分 5 6 次加入研砵中 边加边研磨 用力研磨 20 分钟后 将糊状液体转移到 2 支 50ml 离心管中 平衡后 于 4 12000rpm 离心 15 分钟 收集上清 量体积 V1 FI 留 1ml 上清 FI 放置 20 冰箱保存 用于测定蔗糖酶活力 蛋白含量和 SDS PAGE 分析 2 热处理 热处理 将上一步抽提液 FI 迅速放入 50 水浴中 保温 30 分钟 其间用玻棒 经常搅动 保温结束后迅速用冰浴冷却 3 分钟 平衡 4 12000rpm 离心 10 分钟 收集上清 量体积 V2 F 留 1ml 上清 F 放置 20 冰箱保存 以备测定 3 有机溶剂 乙醇 沉淀 有机溶剂 乙醇 沉淀 将上清置于一烧杯中 加入等体积 20 预冷的 95 乙醇 冰浴中进行 慢慢滴加 边加边用玻棒轻轻搅拌均匀 注意控制在 8 分钟左右加完 再在冰 中放置 20 分钟 然后转移至 50ml 离心管中 平衡 4 12000rpm 离心 10 分 钟 弃上清 沉淀置于 20 冰箱保存 以备用于下次实验 离子交换柱层 析法分离纯化蔗糖酶及测定 4 DEAE Sepharose 分离纯化蔗糖酶分离纯化蔗糖酶 样品处理 样品处理 将乙醇沉淀样品溶解于 8 10ml pH7 3 20mmol L 的 Tris HCl 中 4 10000rpm 离心 10 分钟 收集上清 量体积 V3 F 取 4 5ml F 作离子 交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶 可先做酶活性检测 取 100ul 酶液 经测酶 活力很高 棕黑色 其余置于 20 冰箱保存用于测定 柱层析 柱层析 离子交换剂 DEAE Sepharose 层析柱 1 0 20 洗脱液梯度 含 0 0 5mol L NaCl 的 pH7 3 20mmol L 的 Tris HCl 流速 4ml 10min 收集 管 10min 收集到样品出完为止 上样量 4 5ml F 过柱液 过柱液 F 活性的粗测 活性的粗测 试剂空白F3F4 多管 pH4 6 乙酸缓冲液 ml 1 51 41 4 酶液 原液 ml 00 10 1 50 预热 5min 5 蔗糖 已 50 预热 ml 0 50 50 5 50 反应 8min DNS ml 111 混匀 于 100 保温 5min 取出 比较颜色深浅 颜色强度 过柱液 过柱液 F OD280 的测定的测定 二 蔗糖酶的测定二 蔗糖酶的测定 1 各步纯化步骤蛋白浓度的测定 各步纯化步骤蛋白浓度的测定 蛋白质标准曲线的制作 蛋白质标准曲线的制作 管号 项 目 012345 蛋白质含量 g 50100150200250 蛋白质标准液 ml 0 20 40 60 81 0 无离子水 ml 1 00 80 60 40 2 Follin 酚甲液 ml 5 05 05 05 05 05 0 充分混匀 于 20 25 放置 10 分钟 Follin 酚乙液 ml 0 50 50 50 50 50 5 充分混匀 于 20 25 放置 15 分钟 OD640 nm 标准蛋白质液浓度 250ug ml 各步纯化步骤蛋白浓度的测定 各步纯化步骤蛋白浓度的测定 空白 10 5 2 原液 试管号 项 目 012345678 稀释酶液 ml 00 10 20 10 20 10 20 10 2 无离子水 ml 1 00 90 80 90 80 90 80 90 8 Follin 酚甲液 ml 5 05 05 05 05 05 05 05 05 0 充分混匀 于 20 25 放置 10 分钟 Follin 酚乙液 ml 0 50 50 50 50 50 50 50 50 5 充分混匀 于 20 25 放置 15 分钟 OD640 nm 蛋白含量 mg 平均值 mg 0 1ml 酶液 2 各步纯化步骤酶活力的测定 各步纯化步骤酶活力的测定 葡萄糖标准曲线的制作 葡萄糖标准曲线的制作 试管号 项目01234568 含糖量 mg 葡萄糖标准液 ml 0 10 20 30 40 50 60 7 无离子水 ml 2 01 91 81 71 61 51 41 3 DNS 试剂 ml 11111111 混匀 于 100 水浴中保温 5 分钟 取出经流动水冷却后 再 加 4ml 蒸馏水 混匀 以 0 号管为对照 测定各管的 OD540值 OD540 葡萄糖标准液浓度 1mg ml 各步纯化步骤酶活力的测定 各步纯化步骤酶活力的测定 空白 40 40 20 10 多管 试管号 项目 ml 012345678 pH4 6 乙酸缓冲液 ml 1 51 41 31 41 31 41 31 41 3 稀释酶液 ml 00 10 20 10 20 10 20 10 2 50 预热 10min 5 蔗糖溶液 已预热 ml 0 50 50 50 50 50 50 50 50 5 于 50 准确反应 8 分钟 DNS 试剂 ml 11111111 混匀 于 100 水浴中保温 5 分钟 取出经流动水冷却后 再 加 4ml 蒸馏水 混匀 以 0 号管为对照 测定各管的 OD540值 OD540 还原糖含量 mg 平均值 mg 0 1ml 酶液 酶活力 U 0 1ml 酶液 蔗糖酶活力单位 U 在一定条件下 每分钟能产生 1mg 还原糖的酶量 三 制备过程中的有