分子生物学李众杨中舟ppt课件.ppt

经典基因敲除技术 李众杨中舟王萌 指导老师 韩峰 1 基因敲除载体 2 基因敲除载体导入ES细胞 3 筛选与鉴定 4 基因敲除的应用 重组基因载体的构建 目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因的载体上 此重组载体即为基因敲除载体 载体要包括外源目的基因 同源基因片段及标记基因 经典的基因敲除载体构建方法依赖于同源重组 基因敲除中 同源重组原理 DSBR Double Strandbreakrepair modelSSA single strandanneal modelsingle strandbreak SSB model Martthews Meselsonaetal1974GeneralModelforGeneticRecombinationProc Nat Acad Sci USAVol 72 No 1 pp 358 361 January1975 杨晓基因打靶技术 DSBRmodel 双链断裂修复模型 DSBR 最初是在解释DNA断裂后修复时提出来的 后来在酵母基因敲除过程中发现 但是实验证明在哺乳动物的基因打靶过程中 载体与染色体之间的重组也有此规律 Szostak1983Thedouble strandbreakrepairmodelforrecombinationcell 杨晓基因打靶技术 DSBRmodel 同源重组发生在双链断裂区 断裂区的修复以对应的同源DNA作为模板 修复的断裂区实质上成为基因交换区 DNA末端共价连接成两个Holliday结构 每个结构有两种选择 或形成交换双链 或形成非交换双链 依次对应产生两种产物 一种是DNA与异源组合 载体中的特异序列交换到基因组中 即基因置换产物 另一种是整个载体整合到同源区形成同源区的复制 即基因插入产物 看动画 VickyValancius1991doubled strandbreakrepairinamammaliangenetargetingreactionMolecularandCellularbiology 1 基因敲除载体 1 1选择性标记基因 新霉素磷酸转移酶基因 neo 1 2置换型载体 Repalcementvector 1 neo 3 1 2 3 4 双交换 1 neo 3 4 基因敲除载体 基因组序列 同源重组后的基因组序列 十字交叉点 crossoverjunction 1 3插入型载体 Insertionalvector 1 neo 3 1 2 3 4 单交换 1 2 3 4 基因敲除载体 1 neo 3 基因组序列 基同源重组后的基因组序列 影响基因敲除效率的因素 双链断裂区载体的类型与敲除位点的同源性的程度敲除位点ES的细胞周期 提高基因敲除效率始终是构建载体过程中首先要考虑的因素 载体同源区的任何一处有DSB都能提高重组效率 十字交叉点游离端同源区的大段 载体的类型 用同样的方法对插入型载体和置换型载体敲除 插入型载体的重组效率为置换型的9倍 同时发现置换型载体的重组产物并非完全是基因置换产物 还有大量的基因插入产物 真正达到目的的绝对中靶效率之比为92 1 PaulHasty TargetFrequencyandIntegrationPatternforInsertionandReplacementVectorsinEmbryonicStemCellsMolecularandcellularBiology1991 p 4509 45170270 7306 91 094509 09 02 00 0 选择置换型载体的原因 在构建插入型载体时 5 末端和3 末端分别与质粒和neo相连 因此保留很大的一段保守的同源区 从而使得完整的同源区域靶基因有相同的拓扑结构 而插入目的基因后 拓扑异构又收到限制 这样就使得同源重组正确性和最后发挥作用的可能性提高 PaulHasty TargetFrequencyandIntegrationPatternforInsertionandReplacementVectorsinEmbryonicStemCellsMolecularandcellularBiology1991 p 4509 45170270 7306 91 094509 09 02 00 0 2 基因敲除载体导入ES细胞 基因敲除载体导入ES细胞的方法有很多 如显微注射法 电穿孔法 病毒感染法 DNA 磷酸钙共沉淀法 胚胎干细胞介导法 核移植技术 脂质体法 精子载体法 2 1显微注射法 借助于显微注射仪将基因敲除载体准确地注入细胞 该法是由美国人Gordon于1980年发明的 是制作转基因动物的导入基因敲除载体是目前应用比较广泛 效果比较稳定的方法之一 显微注射法的优点 外源基因转移率高 整合效率较高 例如小鼠为6 40 猪和羊分别为0 98 和0 1 而鱼类通常可达10 75 外源基因的长度不受限制 可导入250Kb左右的DNA片段 可直接用不含原核载体DNA片段的外源基因进行转移 而不需要加入选择性标记基因 显微注射法的缺点 技术难度大 昂贵的设备和非常熟练的技术 一次只能转染一个细胞 无法获得大量的细胞用于筛选 2 3电穿孔法 将打靶载体DNA与悬浮ES细胞混合并进行高压脉冲 DNA可以穿过细胞膜上的孔洞转移到ES细胞中 采用电穿孔法转染ES细胞 在获得理想转染效率的情况下 将导致50 ES细胞死亡 影响转化效率和细胞活力的因素包括电压 离子浓度 DNA浓度及细胞密度 因此 对不同的ES细胞而言 获得理想的转染效率和细胞存活力必须考虑以上各种因素进行预实验 优点 该方法操作的稳定性好 技术相对简便 目前应用最普遍 缺点 转化效率较低 平均转染效率仅达10 3 10 4 3 筛选与鉴定 上世纪80年代中期 发展起来了多种筛选方法 包括物理筛选法 遗传筛选法 前者包括正向筛选和正负筛选法 后者包括PCR筛选法和生化检测法 转染后的ES细胞在经过上述方法的筛选和富集之后 在选择性培养样机中存活下来仍有一部分是随机重组的细胞 因此必须采用PCR或Southern杂交的方法进行鉴定 李湘萍 徐慰倬 李宁动物基因敲除研究的现状与展望遗传200325 1 81 88 3 1正向筛选 标记基因的特异位点表达法 该法基因敲除载体比较特殊 上面仅携带正选择性标记这一种标记基因 而且选择性标记基因缺乏自身的某个表达调控序列 分为无启动子筛选法 启动子缺失筛选 poly A 缺失筛选 无增强子筛选 载体转染到ES细胞后 如果能发生同源重组 或随机整合入细胞基因组内并在整合位点附近恰巧存在相应的表达调控序列 发生概率小 忽略不计 那么残缺的选择性标记基因就能利用基因组上的表达调控序列得到表达 相反 如果没有发生整合 或者随机整合的位点附近没有相应的表达调控序列 选择性标记基因无法表达 从而死亡 无启动子筛选法 该筛选方法建立的敲除载体成为无启动子载体 此载体中的正筛选标记基因是不带启动子的 只有与打靶位点发生正确的同源重组 正筛选标记基因被精确地插入靶基因启动子后 正筛选标记基因才能表达 并使克隆在选择性培养基中存活下来 poly A 缺失筛选 Poly A缺失的正向选择基因neo位于载体的目的片段中 neo基因因缺失转录终止信号 起表达在转录水平受到抑制 在同源重组的细胞中 neo基因利用基因组靶位基因的转录终止信号 得到有效表达 从而使阳性细胞获得G418抗性 非同源重组的细胞中 因存在neo的障碍 不能产生G418抗性 从而实现同源重组转化细胞的富集 优点 基因敲除载体的构建简单 富集效率高 局限性 只适用于在ES细胞中能较好表达的基因 否则即使发生同源重组 选择性标记基因的低水平也无法抵抗筛选药物的作用 基因敲除载体在构建完成以后 必须对其中的同源序列在内的所有元件进行研究 避免前在的表达调控因子的存在 3 2正负筛选 正负筛选 PositiveandNegativeSelection PNS 正负筛选策略是Capecchi等人首先采用的基因敲除筛选策略 这个系统可以同时使用两种正负选择性标记基因 载体 置换型载体 正选择性标记基因 新霉素磷酸转移酶基因 neo 负选择性标记基因 胸腺嘧啶激酶基因 HSK tk 可以在含有更昔洛韦和G418的培养基中富集同源重组的ES细胞 1 neo 3 1 2 3 4 双交换 1 neo 3 4 PNS载体 HSV tk 同源重组 随机整合 neo HSV tk 1 neo 3 5 6 HSV tk 基因组中目标基因 PNS载体 基因组 1 neo 3 HSV tk 5 6 neo HSV tk 1 neo 3 5 6 HSV tk在转染和整合过程中被破坏 得到大部分ES细胞是随机整合 呈现假阳性 1 neo 3 HSV tk 5 6 3 3PCR筛选 引物设计 一条引物与载体上的非同源序列 例如正选择性标记基因 互补 而另一条引物则与载体同源序列之外的内源目标基因序列互补 neo 同源重组 neo HSV tk 置换型载体 基因组序列 PCR neo 插入型载体 基因组序列 同源重组 neo 对ES细胞先进行分组 20 50个克隆一组 对基因组DNA进行筛选优势 操作简单 可以用于转染后ES细胞的直接筛选 适合任何基因的定向敲除 筛选不依赖于选择性标记基因 因此在非选择性培养基中生长的环境对ES细胞的潜在影响较小 也有利于同源重组的细胞形成集落 3 4PCR鉴定 3 5Southern鉴定探针设计 neo 同源重组 neo HSV tk 基因组序列 置换型载体 neo 同源重组 neo 基因组序列 插入型载体 3 5Southern鉴定 采用载体同源序列以外的内源目标基因序列作为探针 先用限制性内切酶消化阳性细胞的基因组DNA 消化产物用电泳分离后通过毛细管转移法或电转移法将其转移到硝酸纤维素滤膜上 再经过探针回交和放射自显影 可以看到与探针杂交的DNA印迹 由于同源重组将导致目标基因所在的酶切片段长度发生特定的改变 因此根据DNA印迹所在的位置就可以确定相应的细胞是否发生了同源重组 鉴定完成后得到的ES细胞经体外遗传修饰之后通过显微注射 胚胎聚合 核移植的方法入动物体胚胎 获得的动物需要进一步的交配建立纯合的基因敲除动物模型 比较正常动物与基因敲除动物的表型差异 可以推测被敲除细胞的功能 4 基因敲除的应用 1989年 卡佩奇关于小鼠基因打靶技术的论文一经公布 立刻引起了全球科学界的轰动 人们比喻这次发现为除阿波罗登月之外的 第二大步 1990年5月卡佩奇指导安德森教授对一名4岁严重免疫复合缺陷症的女孩进行这个缺陷基因的 跟踪和确定 当年7月 美国药物和食品管理局批准了这一基因治疗方案 同时这也是全球第一例真正意义上的基因治疗 并且女孩的病情得以缓解 全球首例基因治疗取得初步成功 4 1基因敲除与医药学 4 1 1在人类疾病动物模型方面 人类几乎所有的疾病都与基因有关 基因敲除动物模型的建立 为研究人类疾病提供了一个崭新方法 尤其是遗传性疾病 OA1 眼球白化症 是一种基因紊乱遗传性疾病 能引起视力严重下降 斜视 光恐怖 眼球震颤 Incerti通过敲除法去除小鼠OA1基因 眼科检查显示眼球底部黑色素不足 临床症状表现与人的相似 从而用来研究OA1的发病机制 文献来源 IncertiB CorteseK PizzigoniA etal Oa1knock2out newinsightsonthepathogenesisofocularalbinismtype1 J HumMolGenet 2000 9 19 2781 27881 4 1 2基因和蛋白功能研究方面的应用 由于基因敲除能准确的敲除特定位点基因 故基因敲除动物将更多地应用于基因和蛋白质功能的研究 Matsumura等构建的kl基因敲除小鼠过早出现和人类衰老相关的多种行为和病理生理改变 如寿命缩短 运动失调 痴呆 白内障 肺气肿 骨质疏松 免疫功能降低等 证明kl基因是抑制衰老的基因 其分泌性蛋白是抗衰老激素 文献来源 卢丽 陈系古 黄冰 基因敲除动物的研究和应用 中国实验动物学报20066 14 153 155 4 1 3药物依赖性研究方面的应用 在传统的药物依赖性研究中 往往选取特异性的受体配体来研究该受体在依赖性中的作用 但这种特异性往往是相对的 剂量改变就可能影响其他受体的功能 所以难以真正确定该受体的作用 而利用基因敲除技术可以选择性敲除某一特定受体基因 获得先天缺失该受体基因的动物 通过比较基因缺失动物和野生型动物在依赖性模型上的行为差别 可以准确判断该受体所发挥的作用 文献来源 卢丽 陈系古 黄冰 基因敲除动物的研究和应用 中国实验动物学报20066 14 153 155药物依赖性研究方面的应用 4 1 4治疗措施研究方面的应用 人类器官移植在人类疾病治疗中起举足轻重的作用 器官来源 器官移植的免疫排斥反应一直未解决 Kuwaki等采用基因敲除法 将引起超急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除 他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪 且已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验 经移植后的狒狒存活了2 6个月 均值为78天 且均未出现超急性排斥反应的表 用此方法培育的动物的器官移植到人体可能无排斥反应 文献来源 卢丽 陈系古 黄冰 基因敲除动物的研究和应用 中国实验动物学报20066 14 153 155 基因敲除模型在免疫学 毒理学 基因治疗方面研究扮演重要作用 Gerlai等指出 目前基因敲除的结果忽略了背景基因的作用 由于敲除基因的缺失 动物机体可能产生一种雪崩式的代偿过程 引起基因的第二次改变 因此有理由相信一个复杂的表型改变与某一特定的基因不是完全一对一的因果关系 文献来源 GerlaiR Zebrafish anuncha