酶活力的测定国标

木瓜蛋白酶活力的测定木瓜蛋白酶活力的测定 一 试剂与溶液一 试剂与溶液 1 三氯乙酸 称取三氯乙酸6 54g 用水溶解并定容至100mL 2 L 酪氨酸标准储备溶液 100 g mL 精确称取L 酪氨酸0 1000g 用1mol L盐酸溶液60mL溶解后定容 至100mL 即为1mg mL酪氨酸溶液 吸取1mg mL酪氨酸溶液10 00mL 用0 1mol L盐酸溶液定容至 100mL 即得到100 g mL的L 酪氨酸标准储备溶液 3 氢氧化钠溶液 20g L 称取氢氧化钠2g 加水搅拌溶解 待溶液到室温后 以水定容 至100mL 搅拌均匀 4 盐酸溶液 1mol L 取22 5ml的浓盐酸溶液 加水定容至250ml 0 1mol L 取1 8ml的浓盐酸溶液 加水定容至200ml 5 酪蛋白溶液 10 0g L 称取标准酪蛋白1g 用少量氢氧化钠溶液润湿 加入相应的缓冲 溶液约80mL 在沸水浴中100 加热回流30min 冷却到室温后转入 100mL容量瓶中 用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度 此溶液在冰箱内 贮存 有效期为3d 使用前重新确认并调整pH至规定值 二 二 分析步骤分析步骤 1 标准曲线的绘制 L 酪氨酸标准溶液 按表1配制 L 酪氨酸稀释液应在稀释后立 即进行测定 表1 L 酪氨酸标准溶液 管号 酪氨酸标准溶液 g mL 酪氨酸标准储备液体积 mL 加水体积 mL 00010 11019 22028 33037 44046 55055 分别取上述所配的溶液 以0管为空白 利用紫外分光光度计于 波长275nm下测定吸光度 以吸光度A为纵坐标 酪氨酸的浓度c为横 坐标 绘制标准曲线 利用回归方程 计算出吸光度为1时的酪氨酸 的量 g 即为吸光常数K值 其K值应在130 135范围内 如不 符合 需重新配制试剂 进行实验 2 样品的测定 待测酶液的制备 称取酶样品1g 然后用磷酸缓冲溶液充分溶 解 定容至50ml 测定 先将酪蛋白溶液置于 40 0 2 恒温水浴中 预热5min 然后按以下流程操作 试管A 空白 加酶液2 00mL 40 0 2 2min 加三氯乙酸4 00mL 摇匀 40 0 2 10min 加酪蛋白溶液2 00mL 摇匀 取出静止10min 过滤 慢速定性滤纸 定容至100ml 测滤液吸光度 试管B 酶试样 需三个平行样 加酶液2 00mL 40 0 2 2min 加酪蛋白溶液2 00mL 摇匀 40 0 2 10min 加三氯乙酸4 00mL 摇匀 取出静止10min 过滤 慢速定性滤纸 定容至100ml 测滤液吸光度 三 计算过程三 计算过程 从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力 单位为u mL 样品的 酶活力按下式计算 X2 X1 V n 8 2 m 10 式 1 式 1 中 X1 由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力 u mL X2 样品的酶活力 u g V 溶解样品所使用量瓶的体积 mL n 稀释倍数 8 反应试剂的总体积 mL 2 吸取酶液的体积 mL m 样品的质量 g 1 10 反应时间 10min 以 1min 计 1 1 标线的绘制 标线的绘制 管号酪氨酸的浓度 g mL 吸光度A峰所在的波长 nm 1100 0850274 2200 1504274 3300 2329724 4400 3011274 5500 3785274 酪氨酸标准曲线 y 0 0074x 0 0083 R2 0 999 0 0000 0 1000 0 2000 0 3000 0 4000 0102030405060 浓度C g mL 吸光度A 吸光度 A 1 时的酪氨酸的量 g 即为吸光常数 K 值 求得 K 134 0135 2 2 样品的测