微生物果胶酶研究进展

微生物果胶酶研究进展微生物果胶酶研究进展 果胶质广泛存在于高等植物中 是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分 植物的 细胞组织间起 黏合 作用 近几年来 果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关 注 能够分解果胶质的酶被称作果胶酶 pectinase 它广泛存在于各种微生物中 细菌 真 菌和放线菌都能产生相关酶类 果胶酶类的应用领域非常广泛 不仅可用于食品工业如水 果加工及葡萄酒生产等方面 还广泛应用于麻类脱胶 木材防腐 生物制浆 环境保护 污物软化处理和饲料等行业中 果胶酶主要分为原果胶酶 聚半乳糖醛酸酶 裂解酶和果 胶酯酶等几大类 研究果胶酶各组分的性质 有利于果胶酶的单一酶种的开发利用 同时 微生物果胶酶的分子生物学研究将有助于更合理地利用果胶酶 1 果胶简介 果胶简介 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以 1 4糖苷键聚合而成的多糖链 常带有鼠李糖 阿拉伯糖 半乳糖 木糖 海藻糖 芹菜糖等组成的侧链 游离的羧基部分或全部与钙 钾 钠离子 特别是与硼化合物结合在一起 1 它存在于所有的高等植物中 沉积于初生 细胞壁和细胞间层 在初生壁中与不同含量的纤维素 半纤维素 木质素的微纤丝以及某 些伸展蛋白 extensin 2 相互交联 使各种细胞组织结构坚硬 表现出固有的形态 果胶分 子的结构因植物的种类 组织部位 生长条件等的不同而不同 其大致的结构简图如图1所 示 总体可分为光滑区 smooth region 和须状区 hairy region 两部分 主要由 HGA RG I 和 RG II 三个结构区域构成 其中 RG II 常以二聚体的形式存在 同其它植物多糖一样 果胶也是多分子的 多分散的 多结构的 有高级空间构象的 也具有一定的相对分子质 量分布 2 果胶酶分类 果胶酶分类 从广义上讲 果胶酶可以被分为3种类型 原果胶酶 可以把不溶于水的原果胶分解为可溶于水的 高聚合体果胶 果胶酯酶 脱去果胶中的甲氧基基团 促使果胶的脱甲酯作用 解聚酶 促使果胶中 D 半乳糖醛酸的 1 4糖苷键的裂解 近来人们提出了更详细分类方法为 3 原果胶酶 protopectinases 多聚半乳糖醛酸酶 Polygalacturonases 裂解酶 pectin lyases PL 果胶酯酶 Pectinesterase PE 2 1 原果胶酶原果胶酶 Briton 等人 4 把能够促使原果胶溶解的酶命名为原果胶酶 根据其作用机理分为两种类型 A 型原果 胶酶与 B 型原果胶酶 前者主要作用于原果胶的内部的多聚半乳糖醛酸区域 而后者主要作用于外部的 连接聚半乳糖醛酸链和细胞壁组分的多糖链 2 2 多聚半乳糖醛酸酶多聚半乳糖醛酸酶 Polygalacturonases 聚半乳糖醛酸酶是在有水环境下促进聚半乳糖醛酸链水解的一种果胶酶 应用最为广泛 根据水解作 用机理不同 它可以分为内切聚半乳糖醛酸酶 E C 3 2 1 15 和外切聚半乳糖醛酸酶 E C 3 2 1 67 外切酶 又可以划分两种类型 一种是真菌外切聚半乳糖醛酸酶 它的终产物是单体半乳糖醛酸 另一种是细菌外 切聚半乳糖醛酸酶 它的终产物是二聚体的半乳糖醛酸 2 3 裂解酶裂解酶 pectin lyases PL 裂解酶 反式消去酶 是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶 裂解酶在 C 4位置 上断开糖苷键 同时从 C 5处消去一个 H 原子从而产生一个不饱和产物 根据其作用机理 以及作用底物的不同 裂解酶可以划分为 内切聚半乳糖醛酸裂解酶 EndoPGL E C 4 2 2 2 外切聚半乳糖醛酸裂解酶 ExoPGL E C 4 2 2 9 内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 EndoPMGL E C 4 2 2 10 外切聚甲基半乳糖醛酸裂 解酶 ExoPMGL 3 果胶酶产生菌 果胶酶产生菌 目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌 5 6 也有链霉菌产生果胶酶的报道 7 在 细菌中 欧文氏杆菌 Erwinia sp 芽孢杆菌 Bacillus sp 节杆菌 Arthrobacter sp 和假单胞杆菌 Pseodomonas sp 都产生果胶酶 嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属主要用于在苎麻和红麻的脱胶 生物 制浆及污物的处理软化等方面 应用前景可观 受到较多的关注和研究 已见报道的产果胶酶的霉菌种类 大约包括20个属 如曲霉属 Aspergillus sp 灰霉菌属 Botrytis sp 镰孢菌属 Fusarium sp 炭疽菌属 Colletotrichum sp 核盘菌属 Scletorium sp 和玉圆斑菌属 Cochliobolus sp 等 目前 黑曲霉 根霉和盾 壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化 国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中 而曲霉属 中研究最多的是黑曲霉 其原因是 果胶酶被广泛应用于食品工业中 如用于果汁 果酒及中药营养液的 深加工等 使得产品质量和外观得以改善 而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株 黑曲霉分泌的胞外 酶系较全 不仅可以产生大量果胶酶 而且黑曲霉属于安全菌株 另外 黑曲霉产生的果胶酶最适 pH 值 一般在酸性范围内 这也是其被应用于食品工业行业中的原因之一 A 型原果胶酶主要来源于酵母及酵母状真菌的发酵液中 研究人员已经从 Kluyveromy cesfragilis IFO0288 Galactomyces reesei L 和 Trichosporon penicilla tum SNO 3 8 中分离出了原果胶酶 依次称为原果 胶酶 F L 和 S PPase F L S 另外从 Bacillus subtilis IFO12113 B subtilis IFO3134和 Tramete sp 菌株 中分离出了 B 型原果胶酶 8 依次称为原果胶酶 B C 和 T PPase B C 和 T 内切聚半乳糖醛酸酶广泛分布于真菌和细菌中 在一些高等植物和寄生于植物的线虫中我们也发现了 此种酶 据报道 现在已经在许多微生物的菌体中发现了这种内切酶 包括 Aureobasidium pullulans Rhizoctoniasolani Kuhn Fusarium moniliforme Neurospora crassa Rhizopus stolonifer Aspergillus sp Thermomyces lanuginosus Peacilomyces clavisporus 等 科研人员已经在大量的 微生物种类中 对内切聚半乳糖醛酸酶进行了克隆复制 在遗传学方面进行了大量的研究 相对而言 产 生外切聚半乳糖醛酸酶的微生物较少 已经报道的产生外切活性酶的微生物有 Erwiniacarotovora Agrobacterium tumefaciens Bacteroides thetaiotamicron E chrysanthemi Altemaria mali Fusarium oxysporum Ralstonia solanacearum Bacillus sp 等 9 11 聚半乳糖醛酸裂解酶 PGLs 可以由多种细菌和一些致病性的真菌产生 内切聚半乳糖醛酸 裂解酶比外切聚半乳糖醛酸裂解酶要丰富 可以从腐烂食物中的细菌和真菌中分离到 PGLs 据报道 从 Colletotrichum lindemuthionum Bacteroides thetaiotaomicron Erwinia cartovora A mucala sp Pseudomonas syringae pv Glycinea Colletotrichummagna E chrysanthemi Bacillus sp Bacillus sp DT 7 C gloeosporioides 等 12 13 菌株中可以分离到此种酶 相比之下关于聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 PMGLs 的产品 却鲜于报道 仅有少数报道指出我们可以从 As pergillusjaponicus Penicillium paxilli Pe nicillium sp Pythium splendens Pichia pinus Aspergillus sp Thermoascusauratniacus 中分离到此种酶 13 16 果胶酶的理化性质 果胶酶的理化性质 3 1 果胶酶活力检测方法果胶酶活力检测方法 掌握可靠的酶分析定量方法是开展果胶酶研究工作的重要前提 果胶酶的测定方法很多 各具特点 且酶活单位的定义不同 要根据不同情况加以选择对比 常用的酶活力测定方法有 17 3 1 1 滴定法滴定法 滴定法主要用于测定果胶酯酶的活力 根据该酶作用机制 采用滴定羧基来评价酶活 果胶酯酶的活 力还有一种测定方法 即 通过气相色谱或液相色谱仪定量分析甲醇 根据甲醇的生成量来评价酶活 此 方法比较精确但要求较高 3 1 2 黏度下降法黏度下降法 黏度下降法基于果胶物质在酶的作用下大分子降解伴随底物溶液黏度下降这一事实 以底物黏度下降 的百分比来评价酶活 该方法所测定的酶活性 主要是反映内切酶酶活 3 1 3 脱胶作用时间法脱胶作用时间法 该方法根据果胶物质在未被酶解之前以及在酶解反应的不同时期能在异丙醇溶剂中形成大小不等的胶 团而判断酶的活性 该方法最能反映内切水解酶和内切裂解酶两种酶在实验条件下的综合能力 3 1 4 还原糖测定法还原糖测定法 无论是内切还是外切果胶酶的作用 长链果胶分子的糖苷键断裂结果都产生还原端基 这些还原端基 的生成量 可用来表示酶活性 最为常用的为 DNS 3 5 二硝基水杨酸 法 3 1 5 235nm 处紫外吸收测定法处紫外吸收测定法 这是专门测定裂解酶活力的一种方法 裂解酶作用于底物经历一个 消除反应 使底物 生成非还原末端 C4 C5之间带有双键的产物 该产物在235nm 处产生最大紫外吸收 酶活 性测定正是根据该反应产物而设计的 3 2 微生物果胶酶的酶学性质微生物果胶酶的酶学性质 国内外科学家利用层析 电泳等手段对果胶酶的酶学性质进行了研究 明确了一些果胶酶的分子量 动力学性质及其影响因素 常用果胶酶纯化方法有 硫酸铵沉淀 丙酮沉淀 离子交换层析以及凝胶过滤 色谱等 果胶酶分子量一般在20kD 60kD 之间 单体存在 个别以多聚体形式存在 如海栖热袍菌果胶 酸裂解酶分子量为115 2kD 结构为四聚体 通常果胶酶活性范围在 pH3 0 9 0 等电点 pH4 0 9 0 其中 最适 pH4 0 6 5的为水解酶 其作用不需要 Ca2 参与 而裂解酶的作用需要 Ca2 参与 最适 pH 为 8 0 10 0 不同菌种所产果胶酶性质有所不同 Alana 等人 18 采用了半固体和液体发酵两种不同的培养方 式 采取凝胶过滤色谱和层析聚焦两种生化手段对 Penicillium italicum 生产果胶酶进行研究 发现两种培 养方式产生的酶分子量 等电点 Km 都相同 分别为22kD 8 6 3 2mg ml 最适作用温度50 最适 pH6 0 7 0 远低于细菌果胶裂解酶最适 pH Co2 Cu2 Fe2 是其抑制剂 不同的是 该菌株液体发酵分泌果胶裂解酶可在低 pH 条件下由高酯果胶诱导 半固体发酵 产生的果胶裂解酶活力高 专一性较差 Bruhlmann F 19 对无枝酸菌果胶裂解酶进行了纯化鉴定 该酶分 子量为31kD 最适 pH 为 l0 25 等电点为10 0 在 pH6 0 8 0内酶活稳定 Ca2 是其保持活性的必需离子 并对该酶降解果胶的产物进行了研究 先通过体积排阻色谱分离果胶酶降解产物 然后由快原子轰击电 离质谱确定其组分 结果显示酶解反应初期就产生了大量的不饱和寡半乳糖醛酸 证明了该酶是内切酶 Saccharomyces eerevisiae 的基因 PGL1 1编码的聚半乳糖醛酸酶 分子量42kD 最适作用温度25 最适 作用 pH4 0 在 pH3 0 5 0内酶活稳定 pH3 0时酶活保留80 耐酸能力极强 20 其它微生物果胶酶的生化特性见表1 21 22 4 果胶酶的生物学研究 果胶酶的生物学研究 4 1果胶酶的理化性质果胶酶的理化性质 果胶酶是作用于果胶质的一类酶的总称 主要功能是通过裂解或 消去作用切断果胶质中的糖苷键 使果胶质裂解为多聚半乳糖醛酸 真菌分解果胶类物质的酶主要是耐酸的多聚半乳糖醛酸酶和耐碱的果胶 裂解酶 以内切型 endo 为主 也有外切型 exdo 一些真菌也产生果胶酯酶和鼠李半乳糖醛酸酶 RHG 等 PG 作用的最适 pH 值一般低于6 大部分 PG 最适作用温度为45 相对分子质量 M 为30 000 50 000 其前体蛋白一般包含360 390个氨基酸残基 基中 N 端信号肽为17 40个残基 PL 一般作用的最适 pH 值大于9 最适作用温度在55 左右 其前体蛋白一般为370 380个残基 但有的低于250个残基 有的 无 N 端信号肽 已报道的 PE 前体蛋白为331个残基 23 25 真菌果胶酶一般有糖基化位点 功能酶以糖蛋白形式存在 如串珠镰孢 Fusarium moniliforme 的 endo PG 前体有4个糖基化位点 玉米圆斑病菌 Cochliobolus carbonum 的 PGX1 N 端有12个残基的糖基化 位点 糖蛋白 M 为60 000 对24种曲霉 PG 的分析表明 一个内藏的 Tyr 残基与酶催化作用关系密切 在 pH l0 5时离子化 一个外露的 Tyr 残基在 pH9 3 9 5时离子化 可能与酶催化有关 串珠镰孢 endo PG 的 His234对酶活性和浸解活性起关键作用 与结合 PG1P 无关 当 His234 Lys 时无酶活 Ser237和 Ser240 Gly 时 酶活性分别降低48 和6 23 27 纤维素结合域 CBD 在纤维素酶和木聚糖酶中广泛存在 但在果胶酶中不常见 目前发现一种来自胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 的果胶酶含有 CBD 这是迄今发现的第一种含有 CBD 的果胶酶 细菌产生的果胶酶的 M 为10 000 80 000 最适作用 pH 值一般中性偏碱 最适作用温度一般为60 左右 菊欧文氏杆菌 Erwinia chrysanthemi 产生8种果胶裂解 酶的同工酶 但其中的 PELI 更易作用于部分甲酯化的果胶 在最适碱性 pH 值和 Ca 2存在的条件下 还 具有内切活性 菊欧文氏杆菌分泌果胶乙酰酯酶 M 为34 9OO 前体蛋白含322个残基 N 端有21个残 基的信号肽 酵母中只有很少一部分株系产生果胶酶 酿酒酵母 Saccharomy cescerevisiae endo PG 的前体蛋白含 360 380个残基 基中 N 端从1 18残基为信号肽序列 381 388残基的位置有糖基化位点 His222为酶的 活性区域 马克斯克鲁维酵母 Kluyveromyces marxianus 产生的 endo PG 的氨基酸序列与真菌的 PGs 有一 定的相似性 N 端25个残基为信号肽序列 218 230残基为 PG 的活性区域 4 2微生物果胶酶基因微生物果胶酶基因 近10年来 已从不同属的真菌 细菌和放线菌中克隆和测序的果胶酶基因至少有70个 表1 其中来 自真菌的超过40个 且大多是多聚半乳糖醛酸酶基因 从中克隆到果胶酶基因的真菌主要有曲霉菌 炭疽 菌 镰刀菌和灰霉菌等 例如目前已从黑曲霉 Aspergillus niger 中克隆到6个多聚半乳糖醛酸酶基因 6种 endo PGs 之间的氨基酸序列同源性达58 68 草莓灰霉 Botrytis cinerea 的6种 endo PGs 的氨基酸序 列同源性达34 73 聚类分析表明分属于3中不同的单系群体 在细菌中 对欧文氏杆菌的果胶酶基 因研究较多 已经从菊欧文氏杆菌中克隆了8个果胶裂解酶基因和2个果胶酯酶基因 8个果胶裂解酶基因 之间的氨基酸序列有很高的一致性 但 Pell 与其他7个不同 它自成一个转录单元 产生果胶酶的酵母菌 株比较少 从酿酒酵母中克隆到的果胶酶基因是内切多聚半乳糖醛酸酶基因 PGL1和 PGU1 在基因组中 均是单拷贝存在的 真菌果胶酶基因的开放阅读框绝大多数被内含子分割 曲霉菌的果胶酶基因均含有内含子 多数为3 4个 最多的达7个 如 A tubingensis 的多聚半乳糖醛酸酶基因 pgaX 除 Bcpgl 不含内含子外 草莓灰霉的其他5个 endo PGs 基因均含内含子 微生物果胶酶基因的表达 与调控许多微生物果胶酶基因已在酵母菌中被正确表达 如茄镰孢豌豆专化型 pelB pelC 和 pelD 的 cDNA 转入巴斯德毕氏酵母 Pichia pastoris 可以表达 果胶酶一般受果胶 植物 维管组织 低浓度的 0 1 D 一半乳糖醛酸 半乳糖诱导 受葡萄糖 较高浓度 1 的半乳糖醛酸 抗体 某些抗菌素 如阿莫西林 植物的 PG 抑制蛋白 PGIP 抑制 有些 果胶酶基因组成型表达 5 果胶酶的应用 果胶酶的应用 5 1利用果胶酶瓦解植物细胞的细胞壁利用果胶酶瓦解植物细胞的细胞壁 5 1 1果蔬汁的生产 果酒的澄清果蔬汁的生产 果酒的澄清 目前 在大部分的原果汁 浓缩果汁的生产过程中 都在使用果胶酶 由于各种水果中果胶的含量差 别较大 而且果胶质的成分也略有差异 因此 要根据不同品种 不同加工目的来确定果胶酶的酶组成 由于 PG 的专一性对果胶的酯化度要求不如 PL 高 在澄清果汁方面往往注重以 PG 为主的酶组成 而在 提高浸出汁 特别是自流汁方面往往注重使用以 PL 为主的酶制剂 5 1 2天然产物的提取天然产物的提取 果胶物质的存在不同程度的影响或阻碍着天然产物的释放 在适宜条件下 植物细胞会发生自溶也可 产生包括果胶酶在内的分解酶类 但这会使待分离产物发生结构改变 甚至产生一些大多数情况下不利于 分离的小分子副产物 因此 靠植物细胞的自身酶系并不利于天然产物的提取 一般应先热失活钝化胞内 酶系 再有选择地进行酶处理 天然色素如葡萄紫 番茄红 紫苏紫 萝卜红等均可使用酶法提取 但所 用果胶酶不得含有花青素酶等杂酶以免影响某些产品色泽 其次 天然生物活性物质提取物是目前中药进 入国际市场的一种理想方式 出口比例已超过中药 并呈上升趋势 可利用果胶酶生产的提取物有 银杏 叶提取物 大蒜油浓缩液 蘑菇浓缩液 人参浆 当归浸膏 甘草液等 另外 在金耳多糖 香菇多糖 金针菇多糖 山楂叶总黄酮 等的提取中也使用了果胶酶 利用酶类提取 不仅可提高萃取率 还可提高 纯度 另外 在油料萃取方面 按照传统的生产工艺 菜籽油 棕榈油 葵花籽油 橄榄油等一般是由正 己烷等脂溶性溶剂萃取制得 而正己烷是一种致癌物质 将果胶酶和纤维素酶 半纤维素酶结合使用 可 破坏油料作物的细胞壁 便于油料的释放 从而提高萃取率 由于酶法提取条件温和 油料中多酚物质和 VE 都有所增加 从而提高油料的稳定性 5 1 3纺织品的生物脱胶纺织品的生物脱胶 用碱性果胶酶处理 代替碱对棉 麻等织物进行煮练加工和整理工艺 以去除初生胞壁中的果胶物质 在比较缓和的 pH 值和温度条件下使处理后的织物手感柔软 强度高 取代了耗能大 污染严重的传统热 碱脱胶工艺 另外 可避免因微生物处理造成的纤维素的降解 5 1 4造纸业的生物制浆造纸业的生物制浆 造纸工业中的生物制浆与纺织品的生物脱胶类似 都是通过果胶酶等酶处理降解植物纤维原料中的果 胶 半纤维素及木质素 使其分散成满足造纸工业不同要求的束纤维或单纤维 以生产柔软 均一 有弹 性的高品质材料 由于纸浆中高分子果胶带负电荷 经酶降解至六糖以下即可将其除去 避免了成品纸的 静电现象 5 2部分分解细胞间质中的果胶物质部分分解细胞间质中的果胶物质 5 2 1带果肉食品的生产带果肉食品的生产 一般常规加工所得到的果肉在必要的高温处理或机械泵出后 成型颗粒量明显减少 硬度降低 直接 影响了产品品质 果胶质在 PE 作用下脱去甲氧基 在钙离子存在下形成凝胶 从而保持了果肉原有的形 状和硬度 以此为基料的产品有果汁 果冻 果肉酸奶 果肉冰淇淋等 5 2 2单细胞产品的生产单细胞产品的生产 所谓单细胞产品是指将生物组织进行转化而形成的完整的单细胞悬液 这种单细胞内各种营养成分保 存完好 表面及内部的张力较小 易稳定存在 而且易被酶类消化 它最初应用于细胞融合技术 随着制 备技术的不断完善 这种单细胞产品可用于婴儿 老人及病人食品中 还可作为美容品中的活性成分 用 于保湿 抗氧化 抑制黑色素生成等 酶法降解植物细胞闻质中的果胶物质产生完整的单细胞悬液的过程 称为浸解作用 maceration 在浸解过程中 一方面设法使内源性果胶酯酶灭活 避免细胞软化 另一方面 用外源果胶酶适度降解胞外果胶及其它成分 避免胞内物质泄漏 降低品质 该工艺常用于生产带肉果蔬 汁饮料 乳制品的配料 即食的干燥土豆泥 胡萝卜泥等食品 以及芦荟 人参 越橘叶 红花等美容保 健品的配料 5 3利用果胶酶生产果胶利用果胶酶生产果胶低聚糖低聚糖 5 3 1以果胶为底物生产低聚果胶以果胶为底物生产低聚果胶 PG 可水解细胞壁中的果胶成分产生聚合度为10左右的寡聚半乳糖醛酸 后者是植物防御反应的诱导 因子 防御作用包括产生有抗真菌活性的抗毒素 抑制蛋白合成的抑制剂等等 而且当 endo PG 与其抑制 蛋白结合以后可进一步激活此防御反应 所以 PG 在植物致病 抗病中具有双重作用 某些中草药中的药 用成分也与果胶成分有关 如艾草叶中的果胶成分是一种生物活性成分 柴胡根中的抗溃疡糖类与果胶分 子中的 RG II 有关 而人参叶中的 RG 也具有抗溃疡作用 柴胡根中的 RG I 能够促进 鼠 B 细胞产生 IL 6 增进机体免疫力 苍术根中的果胶片段具有肠道免疫活性 此外 果胶酶解产物还 具有抑菌活性 可显著抑制乳酸菌的生长 还可作为功能性食品的配料 5 3 2以几丁质 几丁聚糖为底物生产低分子寡糖以几丁质 几丁聚糖为底物生产低分子寡糖 PG 可水解几丁质 几丁聚糖的 1 4 糖苷键 得到水溶性寡糖 这类低分子寡糖具有 多方面的生理功能 如抗肿瘤 抗菌 增强免疫机能 改善肠道微生物区系的分布 刺激 有益菌的生长等 另外 几丁寡糖可作为保水剂 抗菌剂 植物生长调节剂等应用于农业 食品和化妆品业 参考文献参考文献 1 P rez S Rodriguez Carvajal M A Doco T A complex plant cell wall polysaccharide rhamnogalacturonan IL A structure in quest of a function J Biochimle 2003 85 109 121 2 Serge P rez Karim Mazeau Catherine Herv du Penhoat The three dimensional structures of the pectic polysaccharides J Plant Physiol Biochem 2000 38 1 2 37 55 张海燕 吴天祥 微生物果胶酶研究进展 J 酿酒科技 2006 9 82 85 4 Lang C Domenburg H Perspectives in the biological function and the technological application of polygalacturonases J Appl Microbiol Biotechnol 2000 53 366 375 5 Kapoor M Beg QK Bhushan B et a1 Production and partial puriflcation and characterization of a thermo alkalistable polygalacturonasefrom Bacillus sp MG cp 2 J Process Biochem 2000 36 467 6 Antier P Minjares A Roussos S et a1 Pectinase hyperproducing mutants of Aspergillus niger C28B25 for solid state fermentation of cofee pulp J Enzyme Microbial Tehnol 1993 15 254 7 Beg QK Bhushan B Kapoor M et a1 Effect of amino acids on production of xylanase and pectinase from Streptomyces sp QGl1 3 J World J Microbiol Biotechnol 2000 16 211 8 Lang C Domenburg H Perspectives in the biological functionand the technological application of poly galacturonases J Appl Microbiol Biotechnol 2000 53 366 375 9 AlkortaI Garbisu C Llama MJ Serra JL Industrial applications of pectic enzymes a review J Process Biochem 1998 10 Prade RA Zohan D Ayoubi P Mort AJ Pectins pectinases and plant microbe interactions J Biotechnol Genetic Eng Rev1999 l6 361 391 11 Hasunuma T Fukusaki EI Kobayashi A Methanol production is enhanced by expression ofan Aspergillus niger pectin methylesterase in tobacco cells J J Biotechnol 2003 106 45 52 12 Hadj Taieb N Ayadi M Tfigui S Bouabdollah F Gargouri A Hyper production ofpectinase activities by fully constitutivemutant CT1 of PeniciUium occitanis J Enzyme Microbial Technol 2002 30 662 666 13 Innocenzo MD Lajalo FM Effect of gammairradiationons oftening changes and enzyme activities during ripening ofpapaya fruit J J Food Biochem 2001 25 19 27 14 Assis SA Ferreira BS Fernandes P et al Gelatin immobilized pectinmethylesterase for production of low methoxyl pectin J Food Chem 2004 86 333 337 15 Reid I Richard M Purified pectinase lowers cationic demand in peroxide bleached mechanical pulp J Enzyme Microbial Technol 2004 34 499 504 16 Maldonaldo MS Saad AMS Production ofpectiIlesterase and polygalacturonase by Aspergillus n r in submerged and solid state systems J J Ind Microbiol Biotechnol 1998 20 34 38 17 贾月 弓爱君 邱丽娜 等 果胶酶分离纯化及分析方法的研究进展 J 工业微生物 2005 35 1 55 58 18 A1ana A Alkorta I Dominguez J B et al Pectinlyase activityin a Penicillum italicum strain J Applied and Environmental Microbiology 1990 56 375 3759 19 Bruhlmann F Purification and characterization of an extracellular p