实验诊断学2015临床5年

实验诊断学 临床常用免疫学检测,上海交大医学院附属仁济医院赵荣平,免疫学检查由于具有特异性和敏感性，在实验诊断中应用越来越广泛。,immune response,抗原,B淋巴细胞,吞噬细胞,T淋巴细胞,致敏T淋巴细胞,cytokine,浆细胞,antibody,T 记忆细胞,B 记忆细胞,NK,complement,其它,常用免疫检测,常用免疫检测方法,做免疫学检查思考点,方法灵敏性(参考值不一致性）,第一节：体液免疫检查,体液免疫检查主要包含：免疫球蛋白(immunoglobulin)补体(complement),一、免疫球蛋白测定,免疫球蛋白是一组具有抗体活性的球蛋白，由浆细胞合成分泌。免疫球蛋白基本结构 根据重链抗原性可分为5类（、），每个Ig只能和一种轻链结合（ 或）。,IgG IgA IgM IgE特性,免疫球蛋白合成、分泌及主要功能,IgG IgA IgM IgE病理变化,慢性肝炎导致Ig增高机理,随着肝炎病情的加重和时间延长，受损的肝细胞作为自身抗原刺激淋巴系统，分泌大量抗体，使IgG、IgM及IgA同时增高，以IgG增高为主。肝硬化时肝细胞发生片状坏死，造成枯否氏细胞(Kupffer cell)功能失调，不能有效地发挥吞噬滤过作用，失去对抗原的处理能力，使门静脉血中的抗原不能被清除，抗体形成增多。肝脏免疫系统功能严重失调，从而导致B淋巴细胞失控。,二、M蛋白检测,M蛋白（monoclonal immunoglobulins）：由一种单克隆B淋巴细胞异常增殖所产生，具有相同结构和电泳迁移率的免疫球蛋白分子或其分子片段（如轻链），一般不具抗体活性。简述免疫球蛋白合成 正常情况合成一条重链需要18分钟，合成一条轻链只需10分钟，组成一条完整的Ig就会有一条多轻链过剩，过剩的轻链分泌到细胞外，10%肾小管内分解代谢，80%重吸收，10%排出体外（20ug/ml)。正常合成Ig，一个Ig分子只能和一种轻链结合，Ig轻链/ 之比为2：1。,M蛋白检测临床意义,阳性主要见于1.多发性骨髓瘤 2.巨球蛋白血症3.重链病 4.半分子病5.恶性淋巴瘤 6.良性M蛋白血症,过敏原检测,吸入性和食入性多项特异性IgE抗体检测（I型过敏反应）特异性IgE指能与过敏原特异性结合的IgE。特异性IgE是寻找型过敏反应变应原、并进行治疗较好方法。原理将各种过敏原（如花粉、牛奶）与患者血清反应，血清中存在特异性IgE则呈阳性反应。 多项食物特异性IgG抗体检测（食入性）（III型过敏反应）,其它临床常用检测项目介绍,血液、尿液免疫球蛋白总轻链检测血液、尿液免疫球蛋白游离轻链检测血液免疫球蛋白IgG4检测,二、血清补体检测（complement）,补体是主要由巨噬细胞分泌存在于新鲜血液中具有酶样活性的球蛋白，补体不耐热易降解，故补体检测须用新鲜血清。补体有C1-C9(经典途径）及BF、DF、PF、HF、IF（旁路途径）和补体调节因子组成。临床常作总补体活性（CH50）和单一因子C3、C4、BF及C1q检测。,补体两条激活途径区别,经典途径：抗原抗体复合物激活C1和C4、2，形成C3转化酶，然后是C5、6、7、8、9的激活，最后导致靶细胞溶解。 傍路途径：是细菌的内毒素和其它有关因子，直接激活C3，再是C5、6、7、8、9的激活，最后导致靶细胞溶解。 不同点是路径不一样，傍路途径可最快地发挥效应，达到溶靶细胞作用。 其次是激活物质不一样，经典路径激活物质是抗原抗体复合物，产生后才能激活C1，所以需要时间长。傍路途经激活物质是内毒素，细菌感染后一经释放内毒素就能激活C3，所以有最快的反应。,总补体溶血活性（CH50)检测,增高 急性感染、急性组织损伤、恶性肿瘤和风湿病早期，补体增高常与其它血浆蛋白改变相伴随。降低 自身免疫性疾病SLE的活动期 急性肾小球肾炎 冷球蛋白血症等 严重肝病变 先天性缺乏,SRBC,Ab,c,SRBC,Ab,C3、C4、C1q、B因子检测,第二节 细胞免疫检查,淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%40%，是机体免疫系统主要细胞，主要有TLC、BLC、NK、KC，淋巴细胞进一步可分为很多亚型。,淋巴细胞表面标志检测,簇分化抗原CD（Cluster of differentiation）: 细胞在发育分化过程中，细胞表面抗原物质发生变化，CD抗原即指细胞变化过程中不同时期产生的抗原。目前临床CD4（TH）与CD8（TS）检测应用广泛。簇分化抗原检测方法目前较多采用流式细胞仪技术进行分析，流式细胞免疫分析技术为特异抗体加标记技术加单细胞检测。特点：特异性、灵敏性高、检测精密度均较以前手工操作高很多。,流式细胞仪检测简介,一、T细胞表面标志检测,CD3（总成熟T细胞）、E玫瑰花试验检测临床意义 增高：甲亢、淋巴细胞性甲状腺炎、重症肌无力、器 官移植后排异反应 减低：AIDS、胸腺发育不良、联合免疫缺陷、也可见 于放疗和化疗及免疫抑制类药物治疗 CD4、CD8检测临床意义 CD4+增高：类风湿关节炎活动期，自身免疫疾病 CD4+减低：AIDS等病毒感染、免疫抑制剂治疗、严重 创伤、大手术等 CD8+增高：传染性单核细胞增多症和巨细胞病毒感染 急性期、慢性乙型肝炎等 CD8+降低：部分自身免疫性疾病、型糖尿病等,T淋巴细胞表面标志检测,E玫瑰花形成实验（细胞表面受体概念）,TC,SRBC,SRBC,SRBC,SRBC,SRBC,SRBC,SER,SER,SER,SER,SER,SER,二、B细胞表面标志检测,B细胞表面抗原和表面受体检测临床意义表面抗原CD19、CD20、CD21、CD22CD19增高：B细胞系统恶性肿瘤CD19降低：体液免疫缺陷疾病D20在B细胞激活后逐步降低CD21为EB病毒和CD3受体 CD22在B细胞激活时逐步增高 SmIg B细胞表面特异性标志SmIg增高：B细胞恶性增殖相关疾病，如慢淋、毛细胞白血病、巨球蛋白血症。SmIg降低：体液免疫缺陷相关疾病,CD4/CD8测定临床意义,CD4/CD8测定临床意义增高：多见于自身免疫性疾病，如类风关活动期、多发性硬化症、SLE、器官移植后排异反应、膜性肾小球肾炎等降低：AIDS、瘤型麻风病、恶性肿瘤发作期、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染急性期、血吸虫病等。,三、淋巴细胞功能检测,NK细胞活性测定意义目前一般用流式细胞技术NK细胞无需抗原刺激可直接杀伤靶细胞，可释放r干扰素（IFN-r）、 肿瘤坏死因子 （TNF-）和集落刺激因子（GM-CSF）,在机体抗肿瘤和抗感染免疫中发挥重要作用增高：感染早期，器官移植干扰素等免疫增强剂治疗。降低：恶性肿瘤，免疫缺陷疾病，使用免疫抑制剂。抗体依赖性细胞介导的细胞毒测定（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）增高：自身免疫性疾病，移植免疫等降低：恶性肿瘤、免疫缺陷、慢性肝炎、肾功能衰竭等,三、细胞因子检查,细胞因子是由免疫细胞及相关细胞产生，特点高活性、多功能，一般为低分子蛋白。细胞因子种类繁多，功能复杂，多种因子可具有相同功能，各种细胞因子间可互相作用，细胞因子功能同时受到细胞因子受体功能影响，因此在选择检测项目和结果分析时要综合考虑。,四、细胞因子检查,细胞因子种类繁多，功能复杂，多种因子可具有相同功能，各种细胞因子间可互相作用，细胞因子功能同时受到细胞因子受体功能影响，因此在选择检测项目和结果分析时要综合考虑。,目前诊治常用检查提问,诊断试验评价的几个常用指标,敏感度（ Sensitivity）特异度（specificity）受试者工作特征曲线（ accuracy operating characteristic）,敏感度,Clinical Sensitivity指由标准诊断法（金标准）确诊的病例组中经所选实验查出阳性例数，余下既为假阴性。,100%,特异度,Clinical Specificity指标准诊断方法确诊无病的对照组中经所选实验方法查出阴性例数，余下为假阳性。,100%,试验敏感度和特异度选择,一个理想实验方法，最佳临界值，从理论上讲特异度和敏感度最好都为100%，而实际上是不太可能的。敏感度和特异度一般呈反比关系，通常采用统计学理论结合具体疾病选择最合适特异度和敏感度。高敏感度实验适用于： 初筛、初步诊断或排除诊断为目的。高特异度试验适用于： 确诊为目的时一般选择高特异度。凡假阳性结果会导致病人精神和肉体上严重危害，例如肿瘤、HIV携带者要选择高特异度。,理想状态试验敏感度和特异度,真阳性,例数,真阴性,假阴性,假阳性,定量试验结果值,金标准+,金标准-,临界值特异度100%敏感度100%（理想）,临界值,假设：某项目检测临界值为15ng/ml,真阳性,例数,真阴性,假阴性,假阳性,试验结果值,金标准+,金标准-,临界值15ng/ml,临界值,假设：高敏感度情况（临界值降低为5ng/ml）,真阳性,例数,真阴性,假阴性,假阳性,试验结果值,金标准+,金标准-,临界值5ng/ml,临界值,用ROC曲线选择临界值和试验方法,ROC曲线在评价临床检验指标时，可表示该指标敏感度与特异度之间关系。根据曲线不仅可得到决定区分正常与异常临界点的重要信息，还可用于针对同一疾病不同诊断试验间比较。,同一肿瘤二种肿瘤标志物选择,ROC曲线,第三节 肿瘤标志物检测,肿瘤标志物概念：一般而言，TM是指存在于肿瘤细胞内或肿瘤细胞表达及脱落的物质，或是宿主对肿瘤反应而产生的物质。由于肿瘤发生、发展原因至今尚未完全解决，提示肿瘤的标志也并未完全明确，所以肿瘤标志物概念还有待补充和修正。,广义上肿瘤标志物是指与肿瘤发生、发展、消亡相关的各种物质。肿瘤细胞本身产生的肿瘤标志物常分为两类： 1）当理化、病毒、遗传等因素引起正常细胞内基因突变而发生癌变时，癌变细胞内及表达在其表面的蛋白质等成份发生某种变化，形成肿瘤抗原，这种抗原可以表达在正常细胞，而肿瘤细胞表达高。也可因肿瘤导致组织结构变化，肿瘤抗原进入血液，如PSA ；或仅在胚胎组织中表达，正常成人细胞中不表达，在发生肿瘤时又重新表达，如AFP、CEA。,2）由肿瘤细胞产生的特殊抗原，这种抗原在性质上与正常细胞所表达的抗原不同。癌基因的发现证明正常细胞有癌基因存在，只是处于不表达状态，其一旦被激活，就失去正常调控，使细胞发生癌变。而由于癌基因表达产物与肿瘤抗原的关系至今未完全清楚，所以目前未发现很特异的肿瘤抗原。,一般鉴定各种TM的方法为利用所制备的特异Ab从体液或细胞组织中检测各种肿瘤相关抗原。目前也有利用T细胞受体（T cell receptor TCR）识别肿瘤抗原方法。,肿瘤标志物的分类,瘤标志物目前有100多种。尚未有统一全面的分类标准。常分为血清/血浆肿瘤标志物和组织肿瘤标志物。,血清肿瘤标志物,人体器官与肿瘤标志物,理想肿瘤标志物的要求,TM检测临床意义,辅助临床早发现、早诊断帮助区分区分良性与恶性肿瘤协助临床肿瘤类型鉴定及肿瘤部位鉴别帮助临床对肿瘤病程判断治疗效果观察，提前判断复发,甲胎蛋白,AFP由胚胎卵黄囊、胚胎肝细胞及其他内胚层分化的胃肠组织合成。发生在妊娠12周，出生后降低。当肝细胞或生殖腺胚胎组织发生恶性病变时，相关基因重新被激活，细胞重新合成AFP，血液中含量增加。临床应用： AFP增高为原发性肝癌重要指标之一。特异性强、敏感度高相对较高。AFP常用于原发性肝癌临床检查及普查。大部分患者呈持续性高水平升高，部分患者呈低水平增高。,AFP阴性并不排除原发性肝癌，据统计18%-20%的原发性肝癌患者血清AFP正常。此时需结合临床及其他检测指标来降低假阴性。年龄因素：AFP对原发性肝癌的诊断率随患者年龄的增加而逐渐下降。对老年人AFP正常或轻微升高不能排除肝癌的可能性。预后：原发性肝癌血清AFP水平与预后有关。肝癌切除后AFP能否正常或上升是判断预后的关键因素。,其他肿瘤 部分卵黄囊肿患者血清AFP上升，胃癌、结肠癌等内胚层衍生的组织发生的癌，即使未发生肝转移也合成AFP。而非内胚层衍生组织的癌，即使转移到肝脏也不合成AFP，血清AFP是否上升与癌的原发部位有关。与绒毛膜促性腺激素联合检测有助于生殖细胞肿瘤的分类与分期。,肝脏良性病变 肝脏良性病变时，AFP也可增高。病毒性肝炎患者AFP轻度增高，慢性肝炎患者约有20%AFP增高。暴发性肝炎患者AFP明显增高。病理检查时可发现AFP升高与肝细胞再生，同时肝脏受损有关系。,CEA检测,癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一种MW为150K300KD的糖蛋白，1965年Gold和Freedman首先自人结肠癌组织发现，是胚胎性癌抗原。主要存在于胎儿消化道上皮组织、胰脏和肝脏。正常成人血清中CEA含量极低，恶性肿瘤的癌细胞分泌CEA进入血液和淋巴，导致血中CEA水平增高。临床应用： 结肠癌患者70%90%显示CEA高浓度阳性，对于CEA升高的结肠癌患者，血清CEA水平与癌肿大小、有无转移存在一定关系，当发生肝转移时，CEA升高更为明显。,血清CEA水平变化与结肠癌分期密切相关。明显升高时主要见于中晚期肿瘤，进展期结肠癌（Duke分期 C、D期）时阳性率可达70%以上，而Duke A、B期时敏感性只有30%左右其他肿瘤 其他消化道肿瘤也可检测到CEA阳性，如：大肠癌患者可达65%-75%的阳性。CEA与大肠癌的Duke分期有明确关系，可用于治疗效果的监测；内胚层衍生的癌，如胰腺癌、肺癌以及胃癌可导致CEA水平增高。非内胚层衍生的癌，如乳腺癌和子宫癌也能使CEA水平增高。,良性肿瘤10%-20%，以及某些内胚层发生的重症可以导致CEA增高。CEA检测对肿瘤术后复发敏感性很高，可达80%以上。往往早于临床、病理检查、X光检查等。非肿瘤疾病 肠道炎症、肾功不全、结肠息肉、肝硬化、慢性肝炎、闭锁性黄疸等也可导致CEA水平增高 CEA并非一种癌的特异性抗原，而是癌的一种相关抗原。缺少特异性，作为筛选指标时应注意。常用于肿瘤患者的监测，疗效的判断。,前列腺特异抗原（PSA）,PSA为一种丝氨酸蛋白水解酶，存在于前列腺腺泡和导管上皮细胞胞浆中。在血液中以3种不同分子形式存在，即游离PSA；与a1-抗糜蛋白酶（ACT）结合形成PSA-ACT；与a2-巨球蛋白结合形成PSA-a2M。血液中主要为PSA-ACT。正常情况下前列腺腺泡内容物（富含PSA）与淋巴系统间存在由内皮层、基底细胞层和基底膜构成的屏障相隔。当肿瘤或其他病变破坏了这道屏障时，腺管内容物即可漏入淋巴系统并随之进入血液，导致血中PSA水平增高。,临床意义前列腺癌60-90%血清t-PSA增高术后t-PSA无明显降低或再次增高，提示预后较差或肿瘤转移和复发。前列腺增生、前列腺炎等良性疾病也会有轻度增高。肛门指检、前列腺按摩、前列腺手术等也会引起增高，注意鉴别，必要时数周后进行PSA再次检测。f-PSA/t-PSA检测比值下降时对前列腺癌诊断意义较大。,CA 19-9,CA19-9(carbohydrate antigen 19-9)是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因由鼠单克隆抗体116NS19-9识别而命名。是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处。,临床应用：消化道恶性肿瘤 胰腺癌、肝胆系癌、胃癌、结直肠癌的CA 19-9水平分别是正常均值的几百倍。而阳性率以胰腺癌为最高，故CA19-9是胰腺癌较好的标志。胰腺癌诊断中的应用： 大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平明显增高。如果以正常参考范围上限（37 U / mL）为诊断标准，敏感性和特异性均可达90%以上。CA19-9水平与肿瘤的阶段有关，血清中含量的高低提示手术的难易程度，术前CA19-9水平对预后有一定提示作用，低者预后较好，术后CA19-9水平降至正常者生存期长于未下降者。,肿瘤复发时，CA19-