流式细胞术在白血病中的应用

流式细胞术在白血病/淋巴瘤分型和监测中的应用,1,世界卫生组织血液肿瘤分类方案（1999年）,“新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定疾病的真实本质”。“这为世界各国肿瘤学家和病理学家提供了一个全新的与令人兴奋的合作交流新篇章，必将极大促进人们对血液肿瘤的治疗与认识。”（美国临床肿瘤协会，临床肿瘤杂志 17卷3835-3849页，1999年）更重要的是提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。,2,白血病分子诊断的意义,系统诊断,白血病初发,异常标记,精确诊断准确预后指导治疗科研资料,残留监测靶向治疗,免疫/遗传学靶标,MICM诊断,3,WHO血液肿瘤新分类实验技术平台,实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生物学实验技术平台以及掌握这类实验技能并具有专业知识的人员。,4,5,Investigative Tools for MM diagnosis and Management(2008 ASH Education Program Book p298)Patient Evaluation 诊断单克隆蛋白数量和特征血清蛋白电泳和免疫球蛋白定量24小时尿蛋白；总蛋白；本周蛋白尿和血清免疫固定血清自由轻链和比例骨髓检查和骨髓活检Bone marrow aspiration and biopsy组化免疫分型-克隆检定，及通过CD38/CD56/CD19/CD45抗体组合能从90余 例患者正常浆细胞中找到检测残留MM细胞 终末器官损害评价 全血细胞计数；生化检查: 血清肌酐和骨钙测定 预后评估球蛋白，betta-2微球蛋白, LDH, CRP骨髓细胞遗传学和FISH t(4;14), t(14;16), del 17p 针对某些特定患者的特殊研究,6,传统流式细胞术的临床应用细胞计数：CD4、CD34DNA含量：多倍数、S期结果是数据、准确性依赖于良好的质控,传统流式细胞术在白血病免疫表型中的应用单参“白血病表型”，阳性比率大多数细胞为肿瘤细胞多为形态学/细胞化学后的确认数据由临床医师判断,高分辨流式细胞的优点以多参数正常抗原表达为基础结果类似病理报告用于原发性诊断与鉴别诊断用于疾病分期，治疗选择疗效监测，预后判断,流式细胞术,7,骨髓-异质性系统中的应用,多系列 Lymphocyte (T, B, NK) Monocyte Neutrophil Eosinophil Basophil Erythrocyte骨髓中各系列细胞处于连续性成熟阶段必须能涵盖所有细胞,8,应该使用何种抗体？,所有抗体必须为标准的商业化试剂没有什么“秘密武器”或者专门特异的抗体抗体的联合应用能使你从有限的标本中得到最大化的信息量对正常抗原表达的正确认识能帮助你有效地鉴别疾病状态相关的改变,9,高 分 辨 流 式 细 胞 术 能 够 鉴 别 和 分 类 所 有 骨 髓 细 胞,可 以 对 每 一 个 细 胞 进 行 多 特 征 性 的 检 测 并 对 其 相 应 的 系 列 和 成 熟 的 阶 段 进 行 分 类 至 少 检 测 一 万 个 细 胞， 分 辨 率 达 到 0.5 %,10,11,CD45/SS,Wood (2004) Methods Cell Biology 75:559-576,12,正常粒系成熟模式,正常 B 系成熟,Wood (2004) Methods Cell Biology 75:559-576,14,表达交叉系列的抗原非同步抗原共表达：CD34与CD15、CD11b、CD56、CD14抗原的过度表达：早前B-ALL中CD10抗原表达缺失：泛T抗原易位抗原表达：CSF中TdT+淋巴细胞，骨髓中胸腺发育阶段的T淋巴细胞光散射异常：FSC和SSC,白血病相关的免疫表型特点,15,AML-M0,16,AML-M2,17,AML-M3,18,AML-M4,19,AML-M5,20,B-ALL,21,Burkitt淋巴瘤/白血病成熟B-ALL,22,MAL T+G,MAL T+B,23,AUL,24,B-CLL/SLL,25,HCL,26,大B细胞淋巴瘤,27,MM,28,T-ALL,29,NK-LGL,30,报告,包括出现或缺乏的异常细胞群异常免疫表型相比正常细胞群的抗原强度 增强，减弱，缺失定量层面的判断相对于全部CD45阳性细胞 (WBCs)出现的其它细胞群,31,32,TCRV克隆,33,小结,流式细胞术有助于血液系统异常疾病的诊断更加确定的诊断排除其他疾病有助于细分亚型更准确的原始细胞辨别和定量有助于预后判断治疗后监测快速,34,免疫表型分析与FAB分型基于不同的参数对白血病进行分型，两者的结果可一致或不一致；对有些病例，尤其是髓系白血病亚型，免疫表型分析并非特异；对于复杂的病例，需结合多种检查，如特异性染色体核型分析或融合基因综合判断。,35,MRD背景,目前由于多种化疗药的联合应用，使多数白血病患者可以获得形态学的完全缓解（CR）。但多数患者不能维持长期缓解，仍有相当多的患者再次复发。复发的主要原因是患者体内存在少量的形态学难以辨认的残存白血病细胞。 如果能够准确检测患者体内残存的白血病状态，可以有的放矢地进行治疗，使患者避免许多不必要的痛苦。,36,MRD,Outline of Leukemic Diagnosis,Morphology: 1-5%, Cytogenetics: 1-5%, Flow cytometry: 0.1-0.01%, RT-PCR: 0.01-0.001%,CR,Primary leukemia,OS,Chemotherapies,Auto SCT,Allo SCT,Induction,Leukemic cells,1012 1010 109 108 107 106,100%1% 0.1% 0.01 0.001,37,38,Molecular Measurements of Treatment ResponseClinical Application(2008 ASH Education Program Book p367) Application Action 检测治疗早期的反应佳 加强治疗 检测治疗早期的反应差 无需加强治疗 检测复发加强治疗，准备HSCT HSCT前MRD 评估 优化HSCT的时间 HSCT后MRD评估 调整免疫抑制治疗时间，等 临床试验结束时的MRD评估 评价新的抗ALL药物或治疗的结果,39,MRD与预后,当残存白血病细胞10-2，3年复发率为76-94%10-3残存白血病细胞10-2, 3年复发率为37-53%残存白血病细胞10-3, 3年复发率为8-20%残存白血病细胞 95 % 儿童ALL 90-95 % 成人 ALLAML 85% 儿童 AML80-95% 成人 AML,43,报告模板,44,病例一 AML,病例资料：女，3岁，2009.6 初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的26%，主要表达HLA-DR、CD13、CD15、CD33、CD34、CD38、CD117，（CD19+2.27%）。淋巴细胞比例降低。提示：急性髓系细胞白血病（AML-M2可能）。 基因：AML1/ETO 阳性。,45,病例一（续1）,2009.7 化疗 D33：FCM：可见残留，CD33+CD19+细胞约占0.04%。基因： AML1/ETO 阳性。,46,2009.9 D70：FCM：未做。基因：AML1/ETO 阴性。2010.3 D245：FCM：未见免疫表型明显异常的细胞。基因：AML1/ETO 阴性。,病例一（续2）,47,病例二 B-ALL,病例资料：男，3岁，2007.3 初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，CD45弱表达分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的45%，表达HLA-DR、CD10、CD19、CD22、CD34、CD38、Gly-A、cCD79a、TdT。提示：急性B淋巴细胞白血病（普通型B-ALL）。 基因：BCR/ABL阴性。,48,2008.11 化疗 第20个月：FCM：未见明显表型异常的残留白血病细胞。（未附图）基因：未做。2009.09 化疗 第30个月：FCM：可见残留，在CD45dim/-区域可见约1.87%的CD10+CD19+CD20-细胞和约1.55%的HLA-DR+CD19+CD34+细胞，考虑为残留白血病细胞。（见右图）基因：未做。,病例二（续1）,49,病例二（续2）,2010.03 化疗+DC-CIK 第36个月：FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析， CD45阴性略向原始延伸的分布区域可见异常细胞群体，与有核红细胞无分界，共约占有核细胞的89%，主要表达HLA-DR、CD10、CD15、CD19、CD20、CD22、CD34、CD38、cCD79a、TdT。提示：结合病史，考虑急性B淋巴细胞白血病（普通型B-ALL）复发。 基因：ALL基因筛查示TSL/ERG阳性，其余均阴性。,50,病例三 T-ALL,病例资料：女，3岁，2008.10 初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的59%，与淋巴细胞分界不清，表达HLA-DR