细胞培养操作详细

细胞培养 一 细胞的复苏 非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中 需要培养时要先从液氮中取出使之复苏 细胞复苏的 原则 快速融化 必须将冻存在 196 液氮中的细胞快速融化至 37 使细胞外冻存时的 冰晶迅速融化 避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶 对细胞造成损害 具体操作如下 1 实验前准备 1 1 将水浴锅预热至 37 并将含 10 FBS 的培养液置于其中预热 1 2 用 75 酒精擦拭紫外线照射 30min 的超净工作台台面 1 3 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管 吸管 培养瓶等等 2 取出冻存管及迅速解冻 2 1 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号 2 2 从液氮罐中取出细胞盒 取出所需的细胞 同时核对管外的编号 2 3 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻 并要不断的摇动 使管中的液体迅速 融化 约 1 2min 后冻存管内液体完全溶解 取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁 再拿入超净台 内 3 平衡离心 将细胞悬液吸到离心管中 1000 1500rpm 离心 3 分钟 4 制备细胞悬液 吸去上清液 加入 10 ml 培养液 用吸管轻轻吹打均匀 使细胞悬浮 5 细胞计数 细胞浓度以 5 105 ml 为宜 6 培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中 将培养瓶放入 37 和 5 CO2 的 培养箱内培养 略微拧松培养瓶盖 换液的时间由细胞情况而定 通常 除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外 绝大部分细胞株 包括悬浮性细胞 在解冻之后 可直接放入含有 10 15ml 5 10 倍 新鲜培养基的培养角瓶中 待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题 二 细胞的传代 培养的细胞生长至一定密度之后 由于培养液中营养逐渐消耗 代谢物逐步积累 可见到培养 液变黄 而且细胞的生长空间也受到限制 就会影响到细胞的继续生存 这时就需要分离出 一部分细胞和更新培养液 这一过程就叫做传代 1 贴壁细胞的传代 具体操作如下 1 1 传代前准备 1 1 1 预热培养用液 把装有培养液 PBS 和胰蛋白酶的瓶子放入 37 水浴锅内预热 1 1 2 用 75 酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台 1 1 3 正确摆放使用的器械 保证足够的操作空间 不仅便于操作而且可减少污染 1 1 4 点燃酒精灯 注意火焰不能太小 1 1 5 准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶 1 1 6 取出已经预热好的培养用液 用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内 1 1 7 从培养箱内取出细胞 注意取出细胞时要旋紧瓶盖 用酒精棉球擦拭显微镜的台面 再 在镜下观察细胞 并做好记录 1 1 8 细胞培养瓶经用 75 酒精擦拭后 再放入超净台 1 2 胰蛋白酶消化 1 2 1 将瓶盖过酒精灯火焰消毒后 打开瓶盖 靠近酒精灯 小心吸出旧培养液 用 PBS 清洗 2 3 次 沿壁 无细胞的一面 缓缓加入适量消化液 胰蛋白酶液 轻轻摇晃 注意消化液 的量以盖住细胞最好 最 佳消化温度是 37 1 2 2 显微镜下观察细胞 倒置显微镜下观察消化细胞 若胞质回缩 细胞之间不再连接成片 表明此时 细胞消化适度 1 3 吹打分散细胞 1 3 1 弃去大部分消化液 仅留少量在瓶内 并轻轻拍打培养瓶 使细胞分散 然后加入新 鲜的培养液 再用吸管轻轻吹打成细胞悬液 尽可能不要出现泡沫 否则对细胞有损伤 1 4 分装稀释细胞 1 4 1 将细胞悬液吸出分装至 2 3 个培养瓶中 加入适量培养基旋紧瓶盖 1 4 2 倒置显微镜下观察细胞量 必要时计数 注意密度过小会影响传代细胞的生长 传代细 胞的密度应该不低于 5 105 ml 最后在瓶上做好标记 如细胞代数 日期及姓名等 1 5 继续培养 1 5 1 用酒精棉球擦拭培养瓶 适当旋松瓶盖 放入 CO2 培养箱中继续培养 传代细胞 2 小时 后开始贴附在瓶壁上 当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25 时为一个 占 50 为 占 75 时为 2 悬浮细胞的传代 悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉 只留下少量 然后加入新鲜培养液即可 当细胞悬 液中碎片或颗粒物较多 感觉到比较脏时 可以将悬液移到离心管内 1000 1500rpm 离心 3 分钟 弃上清 加入约 2ml 培养液 吹打至均匀 滴加 2 3 滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中 然后置于二氧化碳培养箱中培养 拧松培养瓶盖 三 细胞的冻存 细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温 以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害 1 具体操作如下 1 1 从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存 但最好选择对数增长期细胞 已长 满的细胞冻存复苏后生存率低 在冻存前一天最好换一次培养液 1 2 贴壁细胞经消化 离心 1000 1500rpm 5min 收集 悬浮细胞经离心收集 1 3 大约 106 个细胞加入 1ml 冻存液 10 DMSO 90 血清 用吸管吹打 使细胞分散成单细 胞悬液 1 4 加入到冻存管中 每个冻存管加 1 1 5ml 的细胞悬液 密封 1 5 在冻存管上标明细胞名称及冻存日期 1 6 将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内 管置于 4 半小时 然后置于 20 两小时 再置 于 70 两小时 然后置于液氮上方过夜 第二天将细胞置于液氮中 1 7 记下冻存管存放的位置 作好冻存记录 冻存的细胞名称 代数 冻存日期等 2 注意事项 2 1 使用 DMSO 前 不需要进行高压灭菌 它本身就有灭菌的作用 高压灭菌反而会破华它的 分子结构 以至于降低冷冻保护效果 在常温下 DMSO 对人体有害 故在配制时最好戴上手套 操作 2 2 不宜将冻存细胞放置在 0 60 这一温度范围内过久 低温损伤主要发生在这一温度 区内 是 危 险温区 2 3 注意定期检查液氮罐内液氮量 及时添加 2 4 细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的 但为妥善起见 特别是很多未被冻存过的细胞 在首次冻存 后要在短期内复苏一次 观察细胞对冻存的适应性 已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次 后 再继续 冻存 四 细胞计数 实验原理 当待测细胞悬液中细胞均匀分布时 通过测定一定体积悬液中的细胞的数目 即可 换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目 具体操作如下 1 准备工作 取一瓶传代的细胞 按上述二的传代方法繁殖细胞 待长成单层后以使用 2 细胞悬液制备 细胞悬液的制备方法 用 0 25 的胰蛋白酶液消化 PBS 液洗涤后 加入培 养液 或 Hanks 液或 PBS 等 平衡盐溶液 吹打制成待测单细胞悬液 3 细胞计数 2 1 盖好盖玻片 取一套血球计数板 将特制的盖玻片盖在血球计数槽上 2 2 制备计数用的细胞悬液 用吸管吸适量细胞悬液 如 5 滴 到一离心管中 加入等体积台 盼蓝染液 0 4 或苯胺黑 活细胞不会被染色 加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和 死细胞 若仅是单纯的进行细胞计数 不考虑细胞的活力 则可省略台盼蓝染色步骤 2 3 将细胞悬液滴入计数板 将待测细胞悬液吹均匀 然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴 入 要保证盖片下充满悬液 注意盖片下不要有气泡 也不能让悬液流入旁边槽中 2 4 统计四个大格的细胞数 将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察 并移动计数板 当看 到镜中出现计数方格后 数出四角的四个大格 每个大格含有 16 个中铬 中没有被染液染上色 的细胞数目 2 5 计算原细胞悬液的细胞数 按照下面公式计算细胞密度 细胞悬液的细胞数 ml 四个大格子细胞数 4 2 104 说明 公式中除以 4 因为计数了 4 个大格的细胞数 公式中乘以 2 因为细胞悬液于染液是 1 1 稀释 公式中乘以 104 因为计数板中每一个大格的体积为 1 0mm 长 1 0mm 宽 0 1mm 高 0 1mm3 而 1ml 1000mm3 细胞计数要点 进行细胞计数时 要求悬液中细胞数目不低于 104 个 ml 如果细胞数目很少要进行离心再悬 浮于少量培 养液中 要求细胞悬液中的细胞分散良好 否则影响计数准确性 取样计数前 应充分混匀细胞悬液 尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀 以 求计数准确 数细胞的原则是只数完整的细胞 若细胞聚集成团时 只按照一个细胞计算 如果细胞压在 格线上时 则只计上线 不计下线 只计右线 不计左线 操作时 注意盖片下不能有气泡 也不能让悬液流入旁边槽中 否则要重新计数 注 4 台盼蓝母液的配制 称取 4 克台盼蓝 加入少量蒸馏水研磨 加双蒸水至 100 毫升 用滤纸过滤 4 保存 使用时 用 PBS 稀释至 0 4 五 细胞活力的测定 1 染料排斥试验 其原理是细胞损伤或死亡时 某些染料可穿透细胞膜 与解体的 DNA 结合 使其着色 而活细 胞则能阻止该染料进入细胞内 借此可鉴别死细胞和活细胞 常用的染料有台盼蓝 伊红 Y 和 苯胺黑等 以台盼蓝染色为例 步骤同上述细胞计数的操作步骤 注意以下几点 计数 在 3 10min 内 用血球计数板分别计数活细胞和死细胞 死细胞被染成淡蓝色 活细 胞则拒染 台盼蓝染色时 时间不宜太长 否则活细胞也会着色 从而干扰计数 活细胞率 活细胞总数 活细胞总数 死细胞总数 100 2 MTT 比色实验 可测定测药物或病毒的 IC50 原理 活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐 MTT 还原成紫色不溶性结晶物 沉积 于细胞中 用酸性异丙醇或 DMSO 溶解后 于酶标仪上测定光吸收值 紫色不溶性结晶物形成的 多少与活细胞数目和功能状态相关 2 1 将细胞接种于 96 孔板上 密度为大约 105 个 ml 每孔接种 100 l 2 2 培养至对数生长期加入待测样品 2 3 作用一定的时间之后 加入三蒸水配制的 5 g ml 的 MTT 溶液 每孔 20 l 2 4 37 温育 4 小时 2 5 取出培养板 小心吸去上清 注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀 如果是悬浮细胞则用板离 心机离心后除去上清 2 6 每孔加入 100 l 的 DMSO 摇床上摇动 30 分钟以使沉淀溶解 2 7 用酶联免疫检测仪 DNA Expert 在 595nm 或 490nm 波长处检测 96 孔平板中每孔细胞 的光密度值 OD 值 按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率 细胞存活率 治疗组 OD 值 对照组 OD 值 100 2 8 求出各药物 或病毒 浓度下的 OD 值占对照 OD 值的百分比 用此百分比对药物 或病毒 浓度作图 在所得的曲线上 百分比值为 50 时所对应的浓度就是 IC50 值 或根据各浓度下细胞的存活率 采用 Logit 法计算 IC50 六 细胞的运输 装运细胞的方法有两种 1 冷冻贮存运输 即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存 保存效果较好 但较麻烦 且不能长时间运输 多需空运 2 充液法 2 1 选生长状态良好的细胞 去掉培养液 充满新培养液 液量要达到培养瓶颈部 拧紧螺帽 或塞以胶塞 保留微量空气 若空气留量过多 运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用 2 2 妥善包装 运输 一般在四五天内到达目的地 对细胞活力无多大影响 时间过长则细胞 活力下降 2 3 到达目的地后 倒出大部分培养液 保留维持细胞生长所需的液量 置 37 培养 次日 传代 注 从其他研究室所取细胞时 应注意了解细胞的性状 培养液 培养时的注意事项等 细胞转染 一 脂质体转染 Lipofetmiane 2000 1 转染前细胞的处理 以 24 孔板培养为例 贴壁细胞 在转染前一天 在 24 孔板内铺上 0 5 105 细胞 500ul 无抗生素培养基培养一天 到转染时使细胞达到 80 90 的汇合率 悬浮细胞 在制备混合物前 将 4 8 105 细胞用无抗生素培养基培养铺铺于 24 孔板内 2 转染方法 以质粒 DNA 转染为例 2 1 将 DNA 质粒溶于 50ul 无血清的 Opti MEM Reduced Serum Medium 中 混合均匀 2 2 将适量 Lipofectamine 2000 溶于 50ul 无血清的 Opti MEM 中 混合均匀 在室温下 孵育 5 分钟 在 25 分钟内进行步骤 c 2 3 孵育 5 分钟后 将上述两种混合物混合 总体积 100ul 轻轻混合均匀在室温下孵育 25 分钟 可能出现雾状沉淀 复合无在室温下六小时内稳定 2 4 在 24 孔板中每孔加入 100ul 的复合物以及适量培养基 十字法混合均匀 2 5 细胞在 37 C CO2 培养箱中培养 18 48 个小时后 测量转染效率 在加完复合物 4 6 小 时候可更换培养基 3 转染注意事项 3 1 转染严格来说 每种细胞的条件是不一样的 如果实验时 不能确定最佳转染条件 请在 细胞实验组共享文件夹查找类似细胞的转染方法 3 2 转染结果的好坏 与 DNA 质量密切相关 务必在实验之前对去内毒素质粒 DNA 的质量进行 严格鉴定 至少采用以下两种方法 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测 如果有条件 可对 质粒 DNA 去内毒素质量的进行检测 细胞相关实验操作方法 小量细胞样品 TotalRNA 的提取方法 一 实验步骤 以细胞为例 1 1 细胞样品 1 0 107 个 去上清之后 加入 1ml TRIzol 溶液反复吹打至溶液清亮 转移 入 1 5ml Tube 中室温下放置 10min 如不能立即提取则放于 80 保存 可保存一个月 提 取时取出放于室温融化 也可按照正常冻存方法保存 1 107 个细胞 提取时 37 迅速融化 5000rpm 离心 3min 去除上清液后迅速加入 1ml TRIzol 溶液反复吹打至溶液清亮 室温下放置 10min 1 2 加入 200ul 氯仿 1 5TRIzol 体积 先用枪混匀 10 15 下 再充分颠倒混匀 2min 使两 相充分混合 室温静置 3min 1 3 4 10000g 12000rpm 离心 15min 1 4 小心吸取上清 中间有厚厚的蛋白层 至一新的 1 5ml Tube 中 可取干净 加入 0 5ml 异丙醇 1 2 TRIzol 体积 先用枪混匀 10 15 下 再充分颠倒混匀 2min 室温放置 10min 1 5 4 10000g 12000rpm 离心 10min 1 6 小心吸去上清液 注意不要吸起白色沉淀 加入 1ml 70 乙醇 20 预冷 旋转漂洗 RNA 沉淀 1 7 4 10000g 12000rpm 离心 5min 1 8 小心吸去上清液 空气中干燥 2 3min 加入 84ul DEPC 水充分溶解 RNA 如溶解困难 4 放置过夜 将 RNA 稀释 5 倍 电泳 若是对 RNA 的质量要求不高 做到这一步即可 以下是纯化的步骤 依次加入 2ul RNase Inhibitor 40U ul 10ul 10 DNase I Buffer 4ul DNase I RNase Free 5U ul 充分混匀后 37 反应 60min 1 9 补加 200ul DEPC 水至总体积 300ul 再加入 300ul PCI DEPC 水饱和 充分混匀 5min 室温 10000g 12000rpm 离心 10min 1 10 小心取上清 几乎看不见中间层 取的较干净 于一新的 1 5ml Tube 中 再加入 300ul CI 充分混匀 5min 室温 10000g 12000rpm 离心 10min 1 11 小心取出上清液 几乎看不见中间层 取的较干净 于一新的 1 5ml Tube 中 加入 30ul 3M CH3COONa 充分混匀 1min 后加入 750ul 无水乙醇 20 预冷 充分混匀 2min 20 放置 40min 1 12 4 10000g 12000rpm 离心 15min 小心取出上清 可用枪取干净 1 13 加入 1ml 70 乙醇 DEPC 水配制 20 预冷 旋转振荡清洗 RNA 沉淀 4 10000g 12000rpm 离心 10min 1 14 小心吸去上清液 室温干燥 2 3min 加入 80ul DEPC 水溶解 1 15 分别取 2ul RNA 溶液溶于 10ul DEPC 水中 混匀后各取出 5ul 进行 1 琼脂糖凝胶电泳 根据电泳结果判定 RNA 是否有降解 1 16 按照电泳结果估计 RNA 浓度 按比例使用 TE Buffer PH 8 0 稀释到 0 3 至 0 5OD 吸 光度范围内 二 实验注意事项 1 1 整个实验过程中应该使用橡胶手套和口罩 实验前 使用 70 乙醇擦拭双手和工作台以及 实验用品 1 2 实验用试剂必须保证质量 对 pH 值有要求的必须以灭菌后的测量值为准 1 3 贵重的样品 抽完之后 必须取出一定量作为实验室保存 1 4 必要时 可以将枪头剪掉一部分使用 以免 RNA 大量断裂 PBS 溶液的配制使用以及保存方法 一 试剂用途 实验中主要用来溶解稀释固体试剂 形成含有缓冲体系的盐离子溶液 二 配制 使用和保存方法 1 溶液配制 按 1L 的标准量配制 称取下列药品 NaCl 8 0g Na2HPO4 1 15g KCl 0 2g KH2PO4 0 2g 溶解 定容 使用实验室用超纯水 2 除菌 实验室采用过滤灭菌 使用 0 22 m 的除菌膜 4 保存 3 使用 使用过程中应该保证严格的无菌操作 为了防止污染 可用 50ml 无菌离心管对 dPBS 进行分装 抗生素配制使用以及保存方法 一 原核细胞用抗生素 细胞培养相关实验中 为了防止培养过程中出现细菌污染 需要在培养基中添加双抗 即青霉 素和链霉素 1 药物使用浓度 根据细胞种类的不同 一般 P S 的终浓度保持在 100U ml 具体的实验过程中 可以根据细 胞对抗生素的敏感程度减少或增加双抗用量 原则来说 抗生素的使用范围为 50U ml 200 U ml 2 药物配制方法 干粉状的抗生素 2 1 药物溶解 使用少量的 dPBS 溶液溶解干粉状的抗生素 溶解过程中 应尽量减少 dPBS 的用量 使药物保 持在较高浓度 2 2 溶液除菌 使用 0 22 m 的除菌膜过滤 然后分装 20 保存 2 3 日常使用 按实验要求的终浓度将抗生素溶液添加到培养基当中 注意无菌操作 2 4 注意事项 总的原则是现用现配 尽量减少溶液反复冻融次数 防止抗生素失效 培养基最好是现用现配 在含有血清的完全培养基中 添加抗生素 应 4 保存且有效使用 期不能超过 1 个月 抗生素并非越多越好 在实验细胞条件不明确之前 应该先从最小使用量开始 二 真核细胞用抗生素 本实验室现在常用的真核用筛选标记物主要有两种 neomycin G418 和 Puromycin 实验中 主要用来筛选细胞稳定株或者阳性细胞群落 1 药物配制和保存方法如下 药品保存溶液配制 G418 Prepared in a highly buffered solution e g 100 mM HEPES pH 7 3 or cell culture medium 本实验室使用 dPBS pH 7 3 固体保存 SHELF 20 C This product is stable for 2 years 液体保存 Following reconstitution sterilize by filtration through a 0 22 m or 0 45 mm pore size filter aliquot and freeze 20 C for long term storage or refrigerate 4 C for short term storage assupplied Sterile stock solutions are stable for at least 1 year at 4 C Hygromycin B Sterile filtered at 50 mg ml active antibiotic in PBS Sterile filtered at 50 mg ml active antibiotic in 50mM HEPES PH7 2 本实验室 使用 dPBS pH 7 3 固体保存 Storage at 4 is stable for 2 3years as supplied Puromycin Soluble in H2O 50 mg ml or methanol 20 mg ml 本实验室使用 dPBS pH 7 3 固体保存 Freezer 20 Protect from moisture Following reconstitution sterilize by filtration through a 0 22 um pore size filter aliquot and freeze 20 This product is atable for 2