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文档简介

PCR产物的回收 1 一 实验目的及背景 在生物技术实验中 反应获得的目的片段 酶切后所得特定的 序列 分子杂交中所制备的探针等 经过琼脂糖凝胶电泳后 目的片段与其它 分开 这就需要有一套方法将目的 从凝胶中分离出来 通过处理后得到纯化的目的 以用于以后分子杂交 重组子构建 序列分析等 2 从凝胶中分离回收 的方法 现在常用的技术有 电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法玻璃奶法快速纯化凝胶回收试剂盒 3 低熔点琼脂糖凝胶法 65oC琼脂糖凝胶熔点低熔点琼脂糖凝胶37oC液体 4 电洗脱法基本原理 将电泳分离后含目的 片段的琼脂糖切割下来 装于透析袋中 继续在高电压下电泳 这时目的 会从凝胶中电泳出进入透析袋中 由于 分子量大 不能透过透析袋 从而保留于透析袋中 取出透析袋中含 的溶液 进一步用酚 氯仿抽提纯化 5 二 实验试剂及仪器 DNA回收试剂盒琼脂糖电泳仪 电泳槽紫外检测仪手术刀 6 三 实验步骤 切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带 放入干净的离心管中称重 如凝胶重为100mg 可视为100 l 100mg 100 l 以此类推 加入3倍体积溶液GSB 于55 水浴融胶6 10min 间断 2 3min 混合 确保胶块完全融化 当胶完全融化后 观察溶液的颜色 如颜色为紫色 加入适量3M醋酸钠 pH5 2 调整颜色和GSB颜色相同 黄色 为增加DNA回收量 可加入1倍体积异丙醇于已融化的凝胶溶液中 如凝胶重为100mg 加入100 l异丙醇 待融化的凝胶溶液降至室温 高温时吸附柱结合DNA能力弱 加入吸附柱中静置1分钟 10 000 g离心1分钟 弃流出液 7 4 加入650 l溶液WB 10 000 g离心1分钟 弃流出液 5 10 000 g离心1 2分钟 去除残留的WB 6 将吸附柱置于一干净的离心管中 在柱的中央加入30 50 lEB或去离子水 pH 7 0 EB或去离子水在60 70 水浴预热 使用效果更好 室温静置1分钟 7 10 000 g离心1分钟 洗脱
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