全血细胞分析的质量管理

全血细胞分析的质量管理,分析前质量管理,人员患者准备标本采集储存运送接收等影响因素,人员,在整个质量保证系统中，最为关键的因素是人，包括医生、护士、检验人员和标本运送人员具相应专业学历和相应专业资格数量（明确岗位分工和工作量）培训和考核:内容：专业理论、操作技能、信息系统和生物安全等形式：内部培训、定期学术交流、病案分析等考核：上岗前考核，现场考核，检验结果的分析和解释，形态学工作人员的能力评估等。,患者准备,患者身份的确认；住院患者非紧急状态下，最好每天同一时间段采血；输完脂肪乳要8小时后采血；门诊患者匆忙赶到医院后，最好休息1530min进行采血；挣扎哭闹的小孩最好在安静下来后，休息15min再进行采血。,责任和理念：将每一份标本都看作是无法重新获得、唯一的标本，必须小心地采集、保存、转运、检测、报告。临床反馈检验报告结果不满意、不准确、 不符合病情的，有70 %以上可溯源到分析前质量问题。,标本基本要求,用 EDTAK2抗凝剂，除少数取静脉血有困难的患者可用末梢血外，尽可能静脉穿刺采血。标本的采集可参考 NCCLS H3-A5 文件 诊断血标本静脉穿刺采集程序。取血后最好在 4小时内完成检测。一般不超过8h(涂片后镜检除外)；如果要求检查疟原虫，静脉血标本应在采集后一小时内制备血液涂片。,美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的采血顺序： a)血培养管 b)凝血试验管 c)血清管 d)肝素管 e)EDTA管 f)葡萄糖酵解抑制剂管。,采血顺序,我国卫生行业标准(WS/T 225-2002)推荐的采血顺序：a)血培养管b)无添加剂管c)凝血试验管d)有添加剂管(不同添加剂管按以下顺序采血： 1) 枸橼酸盐管 2)肝素管 3)EDTA管 4)草酸盐/氟化物管),标本运输,温度：在运输到检验科前，标本必须置于室温（1825）下，低温破坏血小板。平稳：泡沫可使血小板激活 ，强烈震荡可使细胞破坏。,标本接收,标识清楚：病人姓名、住院号、科室/床号、性别、年龄、检查项目、采集时间等。拒绝不合格标本：量多或量少，高脂肪、溶血、凝固、污染标本，选择错误试管等。,影响白细胞结果的因素,血小板聚集冷凝球蛋白血症有核红细胞难溶解红细胞(如肝硬化病人)疟原虫,影响红细胞结果的因素,冷凝集综合征大量白细胞高脂血症高胆红素血症巨大血小板Heinz小体、疟原虫、H-J小体、荧光药物等影响荧光染色法网织红计数结果,影响血小板结果的因素,小红细胞和破碎红细胞血小板聚集：抗凝剂EDTA等引起的血小板假性减低；采血不顺引起的血小板聚集储存温度：低温可激活血小板而聚集 稀释液：是否新鲜、洁净，污染可激活血小板而聚集,EDTA依赖性血小板假性减少,原因：不明，可能与血小板表面某种隐蔽性抗原有关。血小板被EDTA活化后，隐蔽抗原暴露，与血浆中存在的自身抗体结合，激活细胞膜中的某些能活化血小板纤维蛋白原受体的活性物质，促使血小板与纤维蛋白原聚集成团。肿瘤、自身免疫病、肺心病、肝病、毒血症等发生率高，健康人也可发生。,处理方法,换用枸椽酸钠作抗凝剂10倍量抗凝剂（10mg/ml EDTA*K2)EDTA与枸椽酸钠按10：1比例混合偶尔有患者对所有常用的血液抗凝剂均出现凝集，可用5mg/ml丁胺卡那霉素抑制或解离血小板的聚集。,其它因素对结果的影响,生理状态：妊娠妇女、新生儿炎症寒冷吸烟一天内不同时间,试剂因素,过期试剂污染试剂:新旧试剂混合不配套的试剂：错用其他仪器试剂,分析中质量管理标准操作规程(SOP)溯源和校准室内质控室间质评在线质控结果比对性能评价,标准操作规程(SOP),全血细胞分析SOP分析仪操作SOP血细胞分析的显微镜复检标准血涂片制备和检查程序对标本进行重复检验的标准及程序：超出仪器线性范围时解决方法，样本中存在一些影响因素（如有核红细胞、红细胞凝集、小红细胞、红细胞有内容物或疟原虫、血小板凝块、巨型血小板等）时，对仪器检测结果可靠性的判定和纠正措施。,溯 源,根据国际血液学标准化委员会（ICSH）颁布文件的要求，血细胞分析的检测结果只有直接或间接地溯源至参考方法，才能保证结果的准确性和不同实验室检测结果的可比性 卫生部临检中心检从2002年起陆续建立血细胞分析不同项目的参考方法，使血细胞分析的检测结果可直接溯源至国际标准。,校 准,1999 年NCCLS 出台的H38-P（建议草案）自动血液分析仪的校准和质量控制,血细胞分析仪校准存在的问题,客观原因：配套校准物的效期短成本高；一些检测系统无配套校准物。主观原因：对校准的重要性认识不够；校准方法未掌握。,血细胞分析仪校准的要求,要求对每一台仪器进行校准建立校准程序并写成文件，内容包括校准物的来源、名称，校准方法和步骤，校准频次等分别对不同吸样模式（静脉血和末梢血）和检测模式（开管与闭管）进行校准使用制造商提供的配套校准物或校准实验室提供的定值新鲜血进行校准,血细胞分析仪校准要求,投入使用前更换部件进行维修后，可能对检测结果的准确性有影响时室内质量控制显示系统的检测结果有漂移时（排除仪器故障和试剂的影响因素后）室间质评成绩欠佳其他（如投诉、更换替代试剂、搬迁等）半年进行一次校准,血细胞分析仪的校准方法,仪器准备（清洗管道，光路调整，更新老化配件，试剂空白，不精密度）校准物的准备（有效期，外观，室温平衡）对校准物进行检测：连续检测11次,弃去第1次的结果，计算均值比较校准物定值与测定均值的偏差 计算公式:偏差=(测定均值-定值)/定值100%,方案1（参考方法）,新鲜血（分为三管）,第1管参考方法定值,其余二管用于待校准血细胞分析仪校准和校准验证,RBC/WBC:单通道阻抗分析仪,PLT,CD41/CD61测PLT/RBC,RBC,Hb(HiCN法),Hct(微量离心法),定值后,多台血细胞分析仪,第1瓶测十一次,血细胞校准物（厂商提供的校准物）,比较结果（百分率差异）,当结果标准百分率差当结果标准百分率差异,仪器调整，求校准系数,第2瓶校准物测定（校准验证）,血细胞分析仪的三种校准方案方案2(厂商提供的校准物)单台血细胞分析仪,方案3（健康人新鲜血）多台血细胞分析仪,新鲜全血10ml（EDTA.K2）,混匀分装三瓶（管）,第1管以已校准检测系统定值（测11次，弃去第1次结果）,第2/3管用于对待校准血细胞分析仪校准和校准验证,校准的判别标准,结果判断,偏差第一列数值，可不调整因子偏差在第一/二列数值之间自动校准求新校准系数=原校准系数(定值/测定均值)偏差第二列数值，请厂商检查原因并排除后,再校准,参考方法,血红蛋白测定ICSH（1995）：人类血红蛋白测量参考方法和国际氰化血红蛋白标准； NCCLS H15-A3（2000），血液血红蛋白定量测定参考方法和程序选择血细胞比容测定ICSH（2001）：血细胞比容测定参考方法ICSH（2003）：血细胞比容测定替代参考方法NCCLS H7-A3（2000）：微量法血细胞比容测定参考方法,红细胞、白细胞计数 ICSH （1994）： 红细胞和白细胞计数参考方法白细胞分类计数 NCCLS H20-A2（2007）：白细胞分类计数（比例）参考方法和仪器计数方法评价血小板计数 ICSH/ISLH（2001）：血小板计数参考方法红细胞/血小板比率测定法（CD41/61）网织红细胞计数 ICSH/NCCLS H44-A2（2004）： 网织红细胞计数法（血细胞计数仪、流式细胞术和活体染色法）,白细胞分类计数校准,白细胞分类参照标准和仪器方法评价：批准标准 (CLSI H20-A2：2007)主要内容：描述自动血液分析仪，依据目视白细胞分类，建立参考方法，用于自动血细胞分析仪或手工白细胞分类的比较。,WBC分类新的参考方法（流式细胞法）,网织红细胞校准,网织红细胞计数方法(自动血细胞计数仪，流式细胞仪，活体染色) H44-A2，2004,网织红细胞流式细胞法,使用特定的碱性荧光染料（哌若宁-Y、吖啶橙、塞唑橙等）：与网织红细胞内的RNA结合后，通过流式细胞技术测定网织红细胞的荧光强度，荧光强度的多少反映了网织红细胞内RNA含量的多少，荧光强度越强，说明RNA含量越多，网织红细胞也就越不成熟，反之亦然。,校准验证,校准完成后应进行校准验证校准验证最好应采用不同批号校准品，或同批采集的已定值的另一管新鲜血标本。与性能已验证的仪器进行比对试验（不同浓度5个标本）如果没有不同批号校准品，只好用同批号未用的第二瓶校准品不能用质控品来进行校准验证,血细胞分析仪室内质控,商品质控物检测患者结果差值控制(Delta Check) 保留患者标本的质控法(Brittin法)浮动均值法(Moving average, Xb)即刻质控法,1.商品质控物检测,质控品的选择质控品的浓度水平质控频度靶值和标准差的确定失控规则的确定Levey-Jennings 质控图Z值图(Westgard多规则质控方法)室内质控的管理,质控品的选择,推荐使用配套质控品，若用非配套质控品，要求与配套质控品进行1个月的平行检测，以评价非配套质控品的质量和适用性。,质控品的浓度水平,要求至少使用2个浓度水平（含正常和异常水平）的质控品。通常有高中低三个不同浓度水平的质控物。CAP提出：在全血分析质控中，10%的偏差在中高值质控结果的数值上表现较为明显，而低值不明显。当低值质控结果提示需进行仪器校准，而中高值质控结果未显示同样的要求时，无法处理，因此不要求做低值水平质控。,质控频率,根据其不精密度、标本的数量定期实施，要求检测当天至少1次。美国CLIA要求不长于8小时做一次。,靶值和标准差的确定,方法1：新批号的质控品，应在旧批号质控品使用结束前新旧批号一起测定，在至少3至4天内的不同时段，分析每水平控制品3至4批，每批重复2至3次，至少20个检测结果，对数据进行离群值检验，剔除超过3S的数据，计算余下数据的平均数。以此均数作为质控图的均值，采用以前接近该均值质控物的变异系数（CV%）来估计新的标准差。20个工作日后采用累积均值和标准差。,靶值和标准差的确定,方法2：每次买同一批号两套质控物，1套质控物与上一批质控物同时检测至少20个工作日，计算累积均值和标准差，另一套质控物使用该累积均值和标准差作实时质控。 制造商规定的“标准值”只能作为参考，通常实验室确定的靶值应在配套定值质控物的允许范围内。,失控规则的确定,实验室应有程序规定使用的规则，至少使用13s规则，多种质量控制规则的使用可以提高误差检出概率。,Levey-Jennings 质控图,与浓度水平对应的靶值和标准差（用2s和 3s画出控制限的范围）仪器质控品的名称、浓度水平、批号和有效期试剂名称和批号每个数据点的日期操作人员的记录,Westgard判断规则,12S规则：1个质控点超出2SD，提示警告；13S规则：1个质控点超出3SD，提示存在随机误差；22S规则：2个连续的质控点超出+2SD或-2SD，提示存在系统误差R4S规则：2个连续的质控点，1个超过+2SD，另一个超过-2SD，提示存在随机误差；10X规则：10个连续质控点在均值同一侧，提示存在系统误差。 41S规则：4个连续质控点超出+SD或-SD，提示存在系统误差；,质控项目：所有检测项目均应开展室内质量控制。质控方法：至少使用L-J质控图方法。利用均值和标准差作Levey-Jennings曲线。计算Z值，作Z值质控图，根据Westgard多规则判断是否存在误差及可能的误差类型。失控报告：要求描述失控情况、核查方法、原因分析、纠正措施及纠正效果等内容。质控数据的管理：原则上每月统计1次，至少保存二年。记录的检查：相关负责人至少每月应对室内质量控制的记录进行检查并签字。,室内质控的管理,2. 即刻性质控方法,对于某些不是每天开展的项目或试剂盒有效期较短的项目可采用即刻性质控方法，只连续测定3次，即对第三次以后的检验结果进行控制。,即刻性质控方法,计算出至少3次测定结果的平均值和标准差；计算出SI上限值和SI下限值： SI上限=（x最大值-x ）/ s SI下限=（x-x最小值）/ s 查SI值表，将SI上限和SI下限与SI值表中的数值进行比较。当检测的数据超过20个以后，可转入使用常规的质控方法进行质控。,即刻性质控法SI值表,即刻性质控法评价,适用性：正态分布或近似正态分布，检测频次低的定量检验项目或定性试验缺陷：结果易受前3个质控数据的影响，在统计学中样本量少时容易出现抽样误差，Grubbs检验法要求样本数据不可少于6个。,3. 患者结果差值控制,方法计算同一患者前一次与本次结果的比较的差异标本间差异(值)=（本次结果-前次结果）/前次结果规定时间范围，质控限,临床应用,当出现失控时，可提示三种情况：患者标本张冠李戴；患者在输液中抽血；患者病情发生变化。,4. 保留患者标本的质控法,方法：选5个患者标本 WBC、RBC、Hb、Hct、MCV、MCH、MCHC 7项指标均在正常范围内，置冰箱过夜，次日晨进行检测。理论基础：新鲜血的上述参数在冰箱冷藏24小时内基本保持稳定,计算,平均差的变化率： 2=(Y2i-Y1i)2/n(其中Y1i：第一天的单个质控标本值；Y2i：第二天的单个质控标本值； ：某项参数第一天的均值； ：该参数第二天的均值；n：标本个数),判断,采用配对t检验进行统计当n=5，tn2.57，p40)； EP15-A3(n20)； 小样本的比对试验（n=5,n=3, n=2）比对频率:至少6个月进行1次比对试验，每月进行1次比对更好。,血细胞分析仪性能评估,安装和培训（辐射、磁场、电信干扰）性能验证：精密度、准确性、线性范围、携带污染率、可比性、抗干扰能力、参考区间等,评估准备,与厂商安排，保证必须、足量的单一批号和多批号（用于批间评估不精密度）的试剂、校准品、质控品，接受过培训的工程师。科室内部：具备完成验证工作的工作人员，包括涉及仪器操作、特殊标本收集、额外标本处理、细节记录、统计分析、评估报告撰写等,精密度,ICSH：批内、批间和总精密度（新鲜血标本）：随机选取 10 例临床新鲜抗凝静脉血样本，每份样本在仪器上连续测定3次。该批样本室温放置2小时后再重复以上操作，计算批内和批间不精密度。随机选取新鲜抗凝血 20份，在仪器上0，2，4小时各测定1次，计算总不精密度。NCCL/CLSI：EP-15评价批内和批间不精密度，采用高中低三个不同浓度水平的质控品,线性验证,高值标本以等渗盐水稀释为 100、90、80、 70、 60、 50、 40、 30、 20 和10，分别测定各稀释标本2次，取其均值作为测定值，并与计算所得各稀释度相应的预期值进行比较。,携带污染率,先取一份高值样本连续测定3 次(H1、H2、H3)，随后立即取一份低值样本连续测定3次（L1、L2、L3）。用下列公式进行计算： 要求：WBC、RBC、Hb、Hct、PLT均1%,准确性,定义：一种测值与真值之间一致性的量。真值必须用肯定/参考方法才能获得 （1991年ICSH定义） 新鲜全血标本用ICSH/CLSI推荐的参考方法进行定值，来验证仪器检测的准确性。单通道阻抗计数仪Coulter Z2（WBC/RBC）、HiCN法(Hb测定) 、微量离心法(Hct测定)、FCM法 (PLT计数)以及NCCLS推荐的手工法（相差显微镜法）。,抗干扰能力,评价严重脂血、黄疸对WBC、RBC、PLT、Hb检测的干扰。可通过添加干扰物的方法，评价添加与未添加TG和BIL标本结果的差异；或根据CLSI EP-7文件进行设计。,参考区间的验证,检测20份健康人标本进行验证CLSI C28-A3临床实验室如何规定和确定参考区间的建议。卫生部首次实施中华医学会检验分会承担 的中国人群重要常规临床检验项目参考区间的建立 计划，包括血液分析。,分析后质量管理,各项结果的分析各种图形的分析异常警告提示的分析显微镜复检结果报告不同类型样本保存的要求废弃物处置方法的最低要求,存在的问题,血细胞自动分析的精密度高，检测速度快，仪器的筛检功能更加完善血细胞形态的多样性和复杂性决定了使用显微镜对血细胞进行复检是必不可少的手段复检可直观地评估和验证自动化分析结果的可靠性，弥补仪器形态学鉴别能力的不足，为临床提供一份全面的血液分析报告,存在的问题,复检比率偏低甚至不镜检据报道国外镜检率5% 95%,国内镜检率为015%，大部分5%或不镜检。未正确发挥自动化分析的筛检功能 一些临床医生对自动化结果不信任，过多地申请白细胞手工分类和血细胞显微镜形态检查，加大了检验工作负担各实验室制定的复检规则差异较大，实施过程中存在一些具体问题,原因分析,各级人员对复检的重要性认识不足复杂程度高，对人员的要求高样本量大，工作烦琐费时，人员数量与工作量不匹配缺乏复检的标准、内容、方法和程序经济效益差培训工作有待加强,血细胞形态学检查引发的医疗纠纷,案例1 患者女，40岁，因干咳而住某院，血常规检查WBC 11109/L，“三分群”血液分析仪MCR 0.19，异常提示F2，未查血片。后患者转北京住院，多次查血常规，嗜酸粒细胞高，确诊为支气管哮喘。先后支付医疗费用较多，认为甲院延误了诊断，要求赔偿。,血细胞形态学检查引发的医疗纠纷,案例2 患者男,36岁,肾结石手术前查血常规，连续两天PLT分别为24和33109/L，未镜检。泌外科医生不给做手术，转血液内科进一步检查。骨髓像正常，外周血片上PLT不少，多成堆分布，再将EDTAK2抗凝血涂片镜检，也发现PLT存在明显聚集，手工计数 PLT214109/L，又转去手术，术中无异常。患者家属认为延误了治疗过程，应处理当事人。,血细胞形态学检查引发的医疗纠纷,案例3 患者女，4岁，因贫血、脾大住院治疗，全血分析RBC 3.11012/L、Hb 72g/L、WBC 8.5109/L、PLT 214109/L、RDW13.6%，未查血象。后患者黄染逐渐明显，查血片：球形红细胞 35%。诊为遗传性球形细胞贫血。,41条规则的出台,2002年由Houwen博士邀请了20位专家组成了国际血液学复检专家组制定了自动化全血细胞计数（CBC）和白细胞分类计数（DC）复检标准，提出了83条规则。提出的规则经15个实验室试用后，通过所得数据的分析，将其整理合并为41条规则,参与的实验室,6个国家的15个实验室，包括了肿瘤医院，儿童医院，社区医院以及其他类型医院的实验室仪器类型 Abbott CellDyn 4000 Bayer