体内药物分析生物样品与样品制备

,第三章 生物样品与样品制备,药物分析教研室,2017/12/10,1,生物样本,学习要求,掌握 常用生物 样本（血液、尿液及组织）的采集、制备、贮存及预处理方法。熟悉常用样品的预处理技术。了解非常用样本的制备与处理方法。,选择生物样本的实验原则,反映浓度与药效之间的关系,1,易于获得，方便研究,2,便于处理，适合分析,3,根据不同目的与要求选取,4,如：TDM、药动学研究选血液、唾液等；药物代谢物研究选血液、尿液；ADMET研究选取？,第一节生物样品的种类、采集、制备与贮存,2017/12/10,5,一、生物样品的种类、采集和制备,体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、脏器组织、唾液、头发，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等。其中最常用的是血浆或血清，因为它们可以较好地体现药物浓度和治疗之间的关系。,2017/12/10,6,（一）血液,血样的制备，如果你取血样会选择血浆、血清还是全血？,2017/12/10,7,血液的组成,2017/12/10,8,血样的采集,供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。动物实验：可直接从动脉、静脉或心脏取血。病人：通常采取静脉血。末梢血：当血药浓度高和分析方法灵敏时，也可从毛细管（手指、耳垂、脚趾）采少量血。,2017/12/10,9,采集注意事项,1:1-5ml，动物总血量1/10 2:避免溶血,3:血样是创伤性获得，尤其是多次采样4:用于药代动力学、血药浓度监测,根据不同的分析目的和要求进行选取,血样的制备,测定血中药物浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。,2017/12/10,11,血样,全血(whole blood)全血含有血球，药物在血球内与血浆中的浓度比由于受各种因素的影响而变化血球膜及血红蛋白会妨碍药物浓度的测定血浆(plasma)血清(serum),2017/12/10,12,（1）血浆的制备,血液置于含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，淡黄色上清液即为血浆。,2017/12/10,13,制备条件,抗凝剂：肝素(heparin)15IU抗凝1ml血浆离心：25003000r min-1低速离心510 min取上清液（淡黄色）,2017/12/10,14,（2）血清的制备,采集的静脉血液置试管中，放置0.5 1 h，由于激活了一系列凝血因子，血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白，血液逐渐凝固，离心后上层澄清的淡黄色液体即为血清。,2017/12/10,15,血浆与血清的相同之处,2017/12/10,16,药物浓度相同Cplasma=Cserum因此：血清和血浆可任意选用分析方法相互通用血药浓度，均指药物的总浓度（游离型+结合型）,（3）全血的制备,采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，轻轻混匀，不离心，防止凝血，保持血浆和血细胞混合在一起。,2017/12/10,17,使用全血的原因,需要测全血中血药浓度的情况测定平均分布于血细胞内、外的血药浓度血浆药物浓度波动大，且难以控制血浆药物浓度太低,18,2017/12/10,示例：,环孢素A的全血浓度的测定,12/10/2017,体内药物分析,20,血样主要应用于： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测,血样的应用,血样的缺点损伤性采样，取样量受到限制（15ml）繁琐，多次采血病人/受试者不愿配合由专人进行,21,（二）尿液,尿药测定的目的与血液、唾液样品不同，主要用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度的研究可推断患者是否违反医嘱用药预测药物的代谢过程及测定代谢类型,22,尿液,2017/12/10,23,1:尿液特点 量大；非创伤性；尿液中药浓度较高。 2:尿液缺点 食物饮；水影响；排汗。3:尿液性质 淡黄色；成人日量1-5L；pH4.8-8.0；加防腐剂贮存。4:采集方法 采集24h尿液：8时排尿弃去，立即服药，尿液收集容器中，次日8时最后一次收集；分段收集5:肾功影响药物的排泄 尿药浓度与血药浓度相关性差；有些难收集（如小孩）。,动物试验中用代谢笼收集尿、粪，只能以时间段采集，有时会有收集不到的情况。尿药浓度变化大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。尿样测定多用于药物排泄、生物转化研究。,2017/12/10,24,优 点,容易获得，属非损伤性取样，且样品量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不需去蛋白处理。,缺 点,与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。,2017/12/10,25,（三）组织,在药物动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器中的分布情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。首先，将检材均匀化，制成水基质溶液，再用适当方法提取。,2017/12/10,26,组织常用提取方法：,（1）匀浆化法（简单，回收率低）（2）沉淀蛋白法（简单，回收率低）（3）酸水解或碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物）（4）酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的药物或毒物）,2017/12/10,27,实例：,以下可采取哪种样品提取方法： 1）利多卡因在肝脏中的组织分布？ 2）阿司匹林在心脏中的组织分布,（四）其他生物样品（自学）,乳汁（乳汁和新生儿）精液泪液头发唾液,2017/12/10,29,二、生物样品的贮存与处理,（一） 冷藏或冷冻 采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应： 短期保存，可 4 冷藏长期保存，可-20 冷冻或低温冷柜(-80)冷冻 ，避免反复冻融。,2017/12/10,30,冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定,12/10/2017,体内药物分析,31,采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后再贮存。若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离。置硬质玻璃试管或完全密塞后保存。 反复冻融一般不超过2次，可采用分装的方法。,血样,12/10/2017,体内药物分析,32,尿样 采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为24-36h(4)或长期(-20),（二）去酶活,酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，则应在采样后立即加入酶抑制剂如氟化钠等。抗氧化剂：一些易氧化的药物，可加入VC或其它抗氧化剂。如血浆中儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量VC，则能保存10周。,2017/12/10,33,奥氮平，很容易被空气氧化，因此在样品的储存和提取时加入了25%的维生素C 溶液10ul 作为抗氧剂,2017/12/10,34,第二节 生物样品的预处理与制备,进行体内药物分析时，除了极少数情况下只需将样品进行简单处理就可以直接测定外，都要采取分离、净化、浓缩、化学衍生化等预处理技术，为测定创造良好的条件。,35,样品预处理是分析中最困难、最繁复的工作。药物进入生物体后： 体内存在形式不同、待测药物浓度低、生物介质组份繁杂、待测药物类型众多、理化性质各异,2017/12/10,36,37,60%以上工作和费用用在样品前处理上,1）样品预处理所用时间远大于分析的时间 2）占分析的消耗总成本最大3）消耗大量的溶剂及其他化学品 4）实验的重复性及准确性最差的环节 因此是影响实验结果好坏的最重要因素,第二节 生物样品的预处理与制备,2017/12/10,38,药物分析样本预处理的目的,适应分析方法的要求消除药物制剂的处方组成多数具有特征结构和取代基的原料药可不经处理，直接溶剂溶解分析。,药物分析样品前处理方法,1、不经有机破坏的前处理方法 不对药物的有机结构进行完全破坏，简单回流将待测原子解离为无机离子测定。 方法 ：水解、还原法如：十一烯酸锌（酸水解）、三氯叔丁醇（碱水解、碘他拉酸（还原法）2、经有机破坏的前处理方法 1中方法难以实现，有机方法。 方法：湿法、干法,一、生物样品预处理的目的,使药物从缀合物及结合物中释放 -测定药物总浓度2.纯化、富集样品 -消除基质的干扰3.满足测定方法对分析样品的要求 -提高检测灵敏度4.保护仪器性能，改善分析条件-改善耐受,2017/12/10,41,二、样品制备时应考虑的问题,待测组分的理化性质、体内存在形式、浓度范围；测定目的；生物样品种类和介质干扰类型；样品的化学组成；药物的蛋白结合率；待测组分在预处理中的稳定性；样品在收集、储存、预处理过程中容器的污染；预处理过程尽量简单、尽可能高的精密度和准确度；预处理的最后一步应使待测组分富集；所选用的分析方法的专属性、灵敏度、分离能力,2017/12/10,42,1药物理化性质 pKa、亲脂性、挥发性、溶解度、光谱特征、稳定性、血浆蛋白结合率2浓度范围3测定的目的定性？定量？母体？代谢？4选用生物样品的种类5样品处理与分析技术的关系 要求 专一性、 灵敏性,2017/12/10,43,三、常用生物样品预处理技术,常用生物样品的预处理大致分为有机破坏法、去除蛋白质法、分离纯化与浓集法、缀合物的水解及化学衍生化法,2017/12/10,44,（一）、有机破坏法,湿法破坏硝酸-高氯酸法；电热消化器法；电热板消化法； 烘箱消化法。干法破坏高温电阻炉灰化法；低温等离子灰化法氧瓶燃烧法以上方法将有机物破坏后，只能进行元素分析，同同时应考虑内源性物质的干扰。,2017/12/10,45,（二）、去除蛋白质,去除蛋白的目的：可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成；可以保护仪器性能，延长使用期限,2017/12/10,46,常用去除蛋白方法,溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂操作简单，快速，精密度好，特别在LC-MS法中常用优点：与血浆蛋白形成的沉淀致密，易离心出去，且沉淀不会挟带走药物。局限：上清液中的微量蛋白可能阻塞HPLC柱，不易挥干浓集。,2017/12/10,47,2. 加入中性盐,中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。,2017/12/10,48,其他方法,3. 加入强酸4. 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 5. 超滤法6. 加热法 7. 酶水解法 适用条件：组织样本或血浆蛋白结合率高的血样 方法：枯草菌溶素，无需剧烈条件，水解后可有机溶剂提取。！：不适于在碱性下易水解的药物（PH7.0-11.0)。,2017/12/10,49,以上去除蛋白质的方法仅去除了蛋白质（只起到保护色谱柱的作用），但内源性的杂质都在，样品浓度还被稀释。基本上不能用光谱法测定。若用色谱法分离，干扰严重，就得花更多的精力才能分离好。对色谱法来说，它不是好方法。,2017/12/10,50,（三）分离、纯化与富集,生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物等组成一个极其复杂的混合物。如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？采取的措施：分离、纯化,2017/12/10,51,1. 液-液萃取法（LLE）,（liquid-liquid extraction，LLE）原理：多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质（差别）。因而，用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。,52,采用LLE要考虑的几个问题,（1）溶剂的选择与纯度要求（AR以上） 了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用；对药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶（光谱分析法）；沸点低、易挥发、浓集；与水不相混溶无毒，不易燃烧；不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）；具有较高的化学稳定性和惰性；不影响紫外测定（如苯类）（毒性大的溶剂尽量不用）,53,液液萃取的溶剂,（2）有机溶剂相和水相的体积,一般为11或21由实际情况决定，文献中有的101以上,55,（3）水相的pH值,主要由药物的pKa决定当pH与pKa相当时，50%药物以非电离形式存在。对于碱性药物，最佳pH值要高于pKa 1-2单位；对于酸性药物，则要低于pKa值1-2单位。这样就可使90%的药物以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中示例：如丙戊酸的pKa4.95，那么最适宜pH是？,2017/12/10,56,但生物样品一般多在碱性下提取。因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中内源性物质多是酸性的，在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来,2017/12/10,57,2.固相萃取法,固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。,58,基本原理和方法：,SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。,59,较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。,2017/12/10,60,针管式 抽空减压 加压 过滤,61,关于固相萃取小柱：a.常见的固相萃取柱分为三部分：医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板(20m)和填料(多为40-60m，80-100m)。,b.常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml为例：其中100mg为填料的质量，1ml是空柱管的体积。c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。,亲脂性键合相硅胶SPE柱的实验步骤：,固相萃取操作一般有五步：活化甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一定的溶剂环境。平衡水或适当缓冲液冲洗小柱，保持湿润？上样将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。弃去废液淋洗水或缓冲液最大程度除去干扰物。洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。,62,操作步骤,2017/12/10,63,2017/12/10,64,SPE优点：,1、不发生乳化；2、适应的极性范围较广；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶剂用量少；6、易于自动化；7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。,65,66,三种方法的优缺点比较,67,4.固相微萃取法,类似于气相色谱微量进样器的萃取装置,熔融石英纤维上面涂有有机聚合物(如聚二甲基硅氧烷，PDMS),SPME 集萃取、浓缩、进样于一身，极大地提高了分析速度。萃取模式可分为直接固